由于影響因素過多,細胞/組織培養(yǎng)中出現的一些問題往往很難分析并得到解決,因此被人戲稱為“黑色藝術”或“巫術”。本文列舉了一些動物細胞/組織培養(yǎng)中常見的問題及解決方法。
1.培養(yǎng)試劑的保存:
血清:-5oC - -20oC 保存,避免反復凍融。
培養(yǎng)基: 2oC – 8oC避光保存。
完全培養(yǎng)基: 2oC – 8oC避光保存,并在2周內用完。
盡量縮短血清和培養(yǎng)基見光的時間
2.液體培養(yǎng)基中谷氨酰胺使用方法:
很多細胞生長要求在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,應置于-20◦C冰凍保存,用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4◦C 冰箱儲存兩周以上時,應重新加入原來量的谷氨酰胺。另一種選擇是使用L-谷氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如啟維益成公司代理的GenDepot的產品Glutaplex配方中含有的成分之一) 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex與L-谷氨酰胺相比更加穩(wěn)定,降解比較慢,提高細胞的存活和生長,極大降低對細胞有毒性的氨的積累。
3.培養(yǎng)基中是否應加酚紅:
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑,中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,特別是雌激素。為避免固醇類反應,培養(yǎng)細胞尤其是哺乳類細胞時,應使用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時不使用加酚紅的培養(yǎng)基。
4.使用血清應注意的問題:
1)血清第一次使用前,是否應在56oC,30分鐘加熱血清以滅活補體系統(tǒng)?
激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞生長只有微小的促進或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率降低。而經過熱處理的血清沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染。而把血清放在37℃環(huán)境中又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間,更確保血清的質量。
2)通常使用的血清的種類:
新生牛血清:新出生牛5天內取血制成。小牛血清:小牛出生16周以內采血制成。胎牛血清:(進口血清)要求剖腹取胎制成。國內廠家往往不能做到,經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。根據血清的生產工藝及血紅蛋白、內毒素含量又分為:(1)特級胎牛血清:40納米過濾,內毒素含量≤10EU, 血紅蛋白含量≤10mg/dl。(2)優(yōu)等胎牛血清:經過3次100納米過濾,內毒素含量≤25EU/ml,血紅蛋白含量≤25mg/ml。(3)標準胎牛血清:3次100納米過濾,低內毒素,低血紅蛋白含量。
3)為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?
有些胎牛血清產品沒有預老化,儲存在2-8℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白,如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。建議在-20℃儲存胎牛血清,避免反復凍融。
4)血清解凍后發(fā)現有絮狀沉淀物出現:
血清中沉淀物的出現有許多種原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成。而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后也會存在于血清中,也是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物并不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無菌離心管內,以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會阻塞過濾膜。
5)如何避免沉淀物的產生?
我們建議您在使用血清的時候,注意下列的操作: (1)解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-2℃至4℃過夜,37oC水浴解凍)。若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),非常容易產生沉淀物。(2)解凍血清時要隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。(4)如果在高于40oC的水浴中融化并且不時常搖晃混勻,非常容易造成沉淀物增多。同樣血清的熱滅活也造成沉淀增多,若非必要,可以省去熱滅活。(5)若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。
5.培養(yǎng)用液pH對細胞生長的影響:
由于,大多數細胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2-7.4,偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同,原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受力差,無限細胞系耐受力強。但總體來說,細胞耐酸性比耐堿性強一些,偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。因此,我們在配制培養(yǎng)用液時,可把液體的pH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時,溶液的pH還會向上浮動0.2左右。
6.培養(yǎng)基pH變化迅速:
培養(yǎng)箱中CO2濃度不正確。碳酸氫鈉在培養(yǎng)液中濃度范圍為2.0 – 3.7g/L時,CO2的濃度范圍應分別為5% - 10%。
7.使用培養(yǎng)基時應注意的問題:
培養(yǎng)基在使用前需37oC預熱。 細胞培養(yǎng)過程中,吸取過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼,防止殘留在吸管內的培養(yǎng)基焦化,將有害物質帶入培養(yǎng)液中。盡量縮短各種液體、細胞的暴露時間,減少污染機會。避免液體間、細胞間的交叉污染。配制完全培養(yǎng)基時,配制的量最好在2周內用完為好。
8.細胞傳代消化時胰蛋白酶的使用問題:
培養(yǎng)細胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg+離子和血清等因素有關。通常情況下,pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力最強。另外,鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。每次進行傳代消化前,一定要用無鈣鎂離子的PBS液或D-Hanks液反復沖洗細胞培養(yǎng)瓶,以便將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈,這樣可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為: (1)0.05%胰蛋白酶-EDTA; (2)0.25%胰蛋白酶-EDTA。多數細胞傳代消化可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA這種消化液。
第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌管中,保存于–20℃,避免反復凍融造成胰蛋白酶活性降低,并可減少污染的機會。
注意:如果選用無血清培養(yǎng)基(如啟維益成公司代理的TNC Bio公司生產的產品 - 完全無動物成分的血清替代品XerumFreeTM與其他培養(yǎng)基混合配制的無血清培養(yǎng)基),在細胞傳代時,不可使用胰蛋白酶消化,因為胰蛋白酶在無血清時可去除細胞膜表面的受體,這種情況應使用AccutaseTM消化。
9.貼壁細胞在用蛋白酶消化時不易分離:
1)培養(yǎng)液中存在酶的抑制劑,可使用無鈣鎂離子的37oC預熱的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍,再消化
2)胰酶濃度太低,使用更高濃度的胰酶,更高濃度的EDTA或不同的酶消化,37oC消化以提高酶活性
3)細胞處于鋪滿狀態(tài)時間太長,形成細胞間的緊密連接,以后注意在細胞鋪滿之前進行繼代培養(yǎng)。
10.細胞分離后形成團塊:
1) 細胞分散過程太過分,如用力吹吸、酶濃度過高、消化時間過長或溫度過高,酶溶液有毒性(如緩沖液pH或滲透壓不正確等)以至基因組DNA從破裂的細胞中釋放出來。解決方法是在細胞懸液中加入1滴無菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。
2)去除上清時,細胞離心的強度太大或時間太長,應使用125g, 10分鐘輕微離心。
11.懸浮細胞形成團塊:
1)培養(yǎng)液中含有鈣鎂離子
2)支原體污染
3)由于過度消化造成細胞裂解,釋放出基因組DNA
12.細胞不貼壁:
1)消化時間過長,細胞膜上的貼壁蛋白被去除了
2)培養(yǎng)基中的血清或貼壁因子(常見于無血清培養(yǎng)基)不足,可在培養(yǎng)基中加入貼壁因子或使用膠原蛋白、多聚L賴氨酸、纖連蛋白等包被的培養(yǎng)瓶。
3)支原體污染
13.離心動物細胞的離心速率:?
回收動物細胞,離心速率一般為300g,5 - 10 分鐘,離心強度過大將造成細胞破裂死亡。
14.細胞生長緩慢:
1)換用了不同的培養(yǎng)基或血清,解決方法是可比較不同培養(yǎng)基成分,用生長實驗比較以前批次和新批次的血清, 提高接種細胞數,使細胞逐步適應新的培養(yǎng)基 。
2)L-谷氨酸等促進細胞生長的成分沒加入,用盡或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如啟維益成公司代理的GenDepot的產品Glutaplex)替代L-谷氨酸
3)支原體污染或低水平細菌或真菌污染
4)培養(yǎng)試劑保存不當
5)接種細胞數太少
6)細胞傳代次數太多
7)細胞傳代時密度太高,應在細胞鋪滿前的指數生長期傳代
15.細胞死亡:
1)培養(yǎng)箱中無CO2,檢查管子有無泄漏,是否需更換CO2罐,盡量減少開關培養(yǎng)箱的次數
2)培養(yǎng)箱溫度不恒定
3)抗真菌劑或抗生素濃度過高,對細胞產生毒性
4)細胞在凍存或解凍過程中被破壞
5)培養(yǎng)基中滲透壓不正確
6)培養(yǎng)基中積累了有毒的代謝產物
16.細胞冷凍培養(yǎng)基的成份:
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,所以不可將DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。
17.DMSO的等級及使用和保存:
冷凍保存使用之DMSO 等級必須為Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4°C。避免反復凍融造成DMSO 裂解而釋出有害物質,并可減少污染的機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。
18.凍存液中的甘油的保存:
要避光保存,見光后甘油轉化為對細胞有毒性的丙烯醛。
19.細胞欲冷凍保存時注意事項:?
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml,融合瘤細胞則以5x106 cells/ml為宜。實際操作時,建議按照細胞生產商建議的細胞密度凍存。凍存?zhèn)鞔螖档偷募毎?br />
20.冷凍保存細胞之方法:?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30-60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘)→ -80℃16-18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase長期儲存,如細胞浸在液氮中,有可能被液氮中的微生物污染。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,再放入液氮槽vapor phase長期儲存。-20℃不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡。也可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,但存活率降低。
21.細胞解凍:
快速解凍,將37oC預熱的培養(yǎng)基逐滴加入解凍的細胞。
22.支原體污染、檢測及處理:
支原體污染在細胞培養(yǎng)中最常見、不易被查覺,但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結果。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的最小微生物,它無細胞壁,形態(tài)呈高度多形性,最小直徑0.2um,可通過濾器。課題組從國外引進細胞株/系也經常出現支原體的污染。支原體在污染細胞后,它通過影響細胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養(yǎng)基中的氨基酸來抑制細胞的生長,并能降低細胞的融合率。因此,在運用各種細胞系進行實驗研究時,首先要證明所用細胞有無支原體的污染。支原體污染后,培養(yǎng)基可不發(fā)生渾濁,細胞病變輕微或不明顯,因此難以發(fā)現。
目前,支原體檢測的方法有以下幾種。(a)相差顯微鏡觀察;(b)低張?zhí)幚淼匾录t染色法; (c)熒光染色法;(d)酶標法; (e)PCR法:這是常用的一種簡便的檢測方法。 此方法靈敏度高,檢測耗時短,樣品量。ㄖ恍50ul細胞培養(yǎng)用液上清),但引物及制劑費用較高。
支原體污染的處理:1)丟棄細胞,培養(yǎng)基及其他培養(yǎng)用試劑 2)重新獲取未污染細胞,新鮮培養(yǎng)基和試劑。