1、傳代保存法:有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí),會(huì)很快死亡,因此在這種情況下,只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存,它是最基本的微生物保存法,例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。
傳代保存時(shí),培養(yǎng)基的濃度不宜過高,營(yíng)養(yǎng)成分不宜過于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長(zhǎng)溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種,則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。
一般地,大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進(jìn)行保存,而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。
傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便,但其缺點(diǎn)也很明顯,如:①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉;②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;③反復(fù)傳代時(shí),菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉(zhuǎn)種,工作量大;⑤雜菌的污染機(jī)會(huì)較多。
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2、液體石蠟覆蓋保存法:該法較前一種方法保存菌種的時(shí)間更長(zhǎng),適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細(xì)菌等的保存。此法可防止干燥,并通過限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌)的保存,而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存。
3、懸液保存法:即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進(jìn)行保存的方法。常用的有,
① 蒸餾水保存法:適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。
② 糖液保存法:適用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗處保存,可長(zhǎng)達(dá)10年。除此之外,也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存。
4、載體保存法:即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種,如
① 土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液,立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥,然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜,土壤需風(fēng)干、粉碎、過篩和滅菌。
使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是:取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜),然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種,培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止,移入干燥器中經(jīng)短時(shí)間干燥或風(fēng)干后密封,冷藏或室溫保存。
② 砂土保存法:取清潔的砂,過60目篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數(shù)次,干燥后,置于試管或安瓶管中保持2~3cm深,再經(jīng)干熱滅菌后,加入1ml菌種培養(yǎng)液,經(jīng)充分混勻后,放入真空干燥器中,完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經(jīng)HCl預(yù)處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌,再進(jìn)行菌種保藏。
③ 硅膠保存法:以6~16目的無色硅膠代替砂子,干熱滅菌后,加入菌液。加菌液時(shí),由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,因而需設(shè)法加以冷卻。
④ 磁珠保存法:將菌液浸入素?zé)胖椋ɑ蚨嗫撞Aе椋┖笤龠M(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,經(jīng)干熱滅菌后,接入菌懸液,最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對(duì)酵母菌很有效,特別適用于根瘤菌,可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間。
⑤ 麩皮保存法:在麩皮內(nèi)加入60%的水,經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng),最后干燥保藏。
⑥ 紙片(濾紙)保存法:將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中,常壓或減壓干燥后,置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進(jìn)行保存。
5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷凍保存法:適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷,而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言,無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié),都會(huì)對(duì)菌體造成損傷,因此當(dāng)采用這種保藏方法時(shí),應(yīng)注意以下幾點(diǎn),
① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞;
② 要選擇適宜的培養(yǎng)基,因?yàn)槟承┪⑸飳?duì)冷凍的抵抗力,常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異;
③ 要選擇合適的菌液濃度,通常菌液濃度越高,生存率越高,保存期也越長(zhǎng);
④ 最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等);
⑤ 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑,以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣,也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑,但對(duì)有些微生物而言,不加保護(hù)劑時(shí)更有效。
⑥ 原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理,但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí),可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。
⑦ 就動(dòng)物細(xì)胞而言,應(yīng)在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫,此后必須盡快降到貯藏溫度;而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言,則不必如此,如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在-35℃范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫,而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍;
⑧ 若進(jìn)行長(zhǎng)期保存,則貯藏溫度越低越好;
⑨ 取用冷凍保存的菌種時(shí),應(yīng)采取速融措施,即在35~40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說,則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后,應(yīng)盡量避免再次冷凍,否則菌體的存活率將顯著下降。
常用的冷凍保存法包括:
① 低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過多,有些可添加保護(hù)劑。此外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi),再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。
② 干冰保存法(-70℃左右):即將菌種管插入干冰內(nèi),再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。
③ 液氮保存法(-196℃):是適用范圍最廣的微生物保存法。其操作步驟如下,
a、裝安瓶管:使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2~1ml的這種溶液分裝于安瓶中,或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
b、熔封安瓶管:若直接貯存于氣相液氮中(-150℃~-170℃)時(shí),則不需熔封。
c、檢查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?~30分鐘后,觀察有無色素進(jìn)入安瓶。
d、緩慢冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30~60min。
e、速冷:最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。
7、冷凍干燥保存法:其原理是首先將微生物冷凍,然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水
分。事實(shí)上,從菌體中除去大部分水分后,細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止,因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存,其過程如圖6-1所示。
在進(jìn)行冷凍干燥時(shí),需注意以下幾個(gè)問題:
a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件:首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說,將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜;菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好;菌液濃度以高為好,如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109~1010/ml。
b、菌株號(hào)碼等的標(biāo)記:可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽。
c、安瓶的準(zhǔn)備:將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,自來水沖洗3次后,蒸餾水刷凈,干燥,塞棉塞,貼標(biāo)簽,干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥。
d、添加保護(hù)劑:常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、Bordelli氏法:取干凈的小試管(8×60mm)塞上棉塞,滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴,然后轉(zhuǎn)動(dòng)小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標(biāo)記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中,在大試管底部事先裝上1.5cm高的(P2O5或KOH),管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,蠟封。將大試管與真空泵連通,抽真空至0.1~0.2mm汞柱時(shí),將玻璃管熔封,置室溫暗處或冰箱保存。