食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號(hào)

亞硫酸鹽還原菌及檢測(cè)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-05-11
核心提示:一、生物學(xué)特性與衛(wèi)生學(xué)意義  亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細(xì)菌,而不是一個(gè)生物學(xué)分類單位。多指厭氧

一、生物學(xué)特性與衛(wèi)生學(xué)意義

  亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細(xì)菌,而不是一個(gè)生物學(xué)分類單位。多指厭氧芽胞桿菌,代表性菌株是致黑梭狀芽胞桿菌,其他常見的還有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌等。此類細(xì)菌的主要特征是將亞硫酸鹽還原為硫化物,多為有動(dòng)力的革蘭氏陽(yáng)性菌,可形成芽胞,厭氧生長(zhǎng)。

  厭氧亞硫酸鹽還原菌的孢子在自然環(huán)境中廣泛存在,通常出現(xiàn)在人和動(dòng)物的糞便排泄物,廢水和土壤中。與大腸桿菌和其它桿菌不同的是,由于它們的孢子比營(yíng)養(yǎng)體對(duì)物理和化學(xué)因子具有更強(qiáng)的抵抗力,所以可以在自然環(huán)境中存活很大時(shí)間。因而,通常將他們作為長(zhǎng)期污染或間斷污染的指示菌。它們甚至可以抵抗正常水處理所用氯的工作濃度,因此,它們對(duì)判斷是否已達(dá)到控制目的非常有用。

  由于此類細(xì)菌抵抗力強(qiáng),即使在經(jīng)適當(dāng)加工處理的加工食品中其芽胞仍會(huì)存活,條件適宜時(shí)又會(huì)生長(zhǎng)繁殖,造成食品品質(zhì)降低或腐敗,甚至?xí)鹗澄镏卸镜奈kU(xiǎn)。因此在食品的制備、貯存以及食品加工廠環(huán)境衛(wèi)生控制上頗受重視,作為食品、礦泉水、加工設(shè)備衛(wèi)生、生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況的評(píng)估指標(biāo),正確得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

  該類細(xì)菌的檢測(cè)多用于環(huán)境水質(zhì)和生活飲用水污染狀況的評(píng)估,在九十年代中后期開始在食品衛(wèi)生領(lǐng)域中有所要求,但多局限于歐洲國(guó)家和地區(qū),如法國(guó)、瑞士、英國(guó)、捷克等歐盟成員國(guó)。到目前為止,該菌一般不被作為食品衛(wèi)生常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目和致病菌檢測(cè)內(nèi)容,我國(guó)和美國(guó)未將該檢測(cè)項(xiàng)目列入食品微生物檢測(cè)項(xiàng)目和要求中。

二、檢測(cè)方法

  由于此類細(xì)菌以形成芽胞、厭氧生長(zhǎng)和還原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征,往往無(wú)需作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,因此在檢測(cè)中將滿足以上三個(gè)條件的一群細(xì)菌全部認(rèn)定為厭氧亞硫酸鹽還原菌。

  檢測(cè)方法一般包括以下三部分:檢樣在接種前在80-100℃水浴中處理10-15分鐘,以殺滅抵抗力弱的芽胞細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體,同時(shí)刺激芽胞的繁殖;通過選擇性培養(yǎng)如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有還原亞硫酸鹽的能力,如果有則進(jìn)一步與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反應(yīng),使菌落呈現(xiàn)黑色;培養(yǎng)基接種后置于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)確認(rèn)厭氧特征。也可在培養(yǎng)基中加入抗生素等抑制劑抑制其它非亞硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)。

  下面詳細(xì)介紹亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法。

1.培養(yǎng)基和試劑

1.1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液

1.2 亞硫酸鐵瓊脂

1.3 過氧化氫試劑

2.儀器和設(shè)備

2.1 均質(zhì)器:用于處理固體樣品

2.2培養(yǎng)罐(箱),帶產(chǎn)生厭氧環(huán)境的設(shè)備或試劑

2.3 恒溫培養(yǎng)箱:37±1℃或46±1℃

2.4 振蕩器

2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度

2.6 培養(yǎng)皿:直徑為90mm

2.7 稀釋瓶:容量為500mL和250mL的廣口瓶

2.8 天平:感量0.1g

3.抽樣和試樣制備

3.1 抽樣

  參照SN0330-94規(guī)定抽樣

3.2試樣制備

  無(wú)菌操作稱取剪碎后的樣品25g,置于裝有225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的廣口瓶中。若檢測(cè)亞硫酸鹽還原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min熱處理樣品,之后以流水迅速冷卻至室溫后再稱取。充分混勻后據(jù)樣品污染情況做進(jìn)一步的系列十倍梯度稀釋。

4.檢驗(yàn)步驟與計(jì)數(shù)

4.1菌落計(jì)數(shù)法

  適用于檢查未經(jīng)加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽還原梭菌計(jì)數(shù)>10g(mL)的食品。

4.1.1接種和培養(yǎng)

4.1.1.1對(duì)每一份試樣,選用適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣液,分別用滅菌吸管吸取1 mL,一式雙份地接種于每個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中。

4.1.1.2 傾注約15 mL制備好的并于水浴箱保溫至45℃的亞硫酸鐵瓊脂。從制備最初稀釋液結(jié)束到傾注培養(yǎng)基于最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不應(yīng)超過15min。仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻,水平放置,使其凝固。

4.1.1.3待混合物凝固后,在傾注10 mL同樣的培養(yǎng)基于已凝固的培養(yǎng)基上作為隔層以防氧吸附,并防止細(xì)菌蔓延生長(zhǎng)。

4.1.1.4 待該隔層凝固后反轉(zhuǎn)制備好的平板,于37±1℃厭氧培養(yǎng)24-48h。若對(duì)培養(yǎng)溫度有特殊要求(如46℃),可依據(jù)情況進(jìn)行培養(yǎng)。

4.1.2計(jì)數(shù)

4.1.2.1亞硫酸鹽還原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厭氧培養(yǎng)24h后,計(jì)數(shù)典型的菌落;若平板上無(wú)特征性菌落或菌落較小(<0.5mm),則需繼續(xù)培養(yǎng)24h再計(jì)數(shù);若48 h后的菌落增大以至相連,則以24 h的計(jì)數(shù)為準(zhǔn),反之則以48h為準(zhǔn)。

  那些僅產(chǎn)生氫(而不是H2S)的厭氧菌生長(zhǎng)時(shí)也可還原亞硫酸鹽而導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)彌散的、非典型的普遍變黑,這種現(xiàn)象不應(yīng)計(jì)數(shù)。

4.1.2.2取特征性菌落(不少于5個(gè))移種于皰肉培養(yǎng)基中,37±1℃厭氧培養(yǎng)24-72 h。待出現(xiàn)生長(zhǎng)特征(培養(yǎng)液渾濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味)后,按5條進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)。

4.1.2.3讀取帶有10-100個(gè)黑色菌落的平皿,結(jié)果以相應(yīng)稀釋度的兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算每克樣品中亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)。結(jié)果報(bào)告如下:估計(jì)亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(mL)。

  若相應(yīng)測(cè)試試樣的兩個(gè)平板上均無(wú)特征性菌落,以<10/g(mL)報(bào)告

4.2最近似值(MPN)法

  適用于檢查亞硫酸鹽還原梭菌計(jì)數(shù)≤10 g(mL)及含有受損傷的亞硫酸鹽還原梭菌的加工食品。

4.2.1接種和培養(yǎng)

4.2.1.1增菌

  選用適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋的樣液,從每個(gè)樣液中分別吸取1mL,一式三份地接種于3管裝有皰肉培養(yǎng)基的試管中,接種后上面覆蓋一層無(wú)菌的液體石蠟,37±1℃培養(yǎng)24-72h。待出現(xiàn)生長(zhǎng)特征(培養(yǎng)液混濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味)后,按5.1條進(jìn)行鏡檢。反之,則報(bào)告陰性。

4.2.1.2分離培養(yǎng)

  取4.2.1.1增菌培養(yǎng)物1mL置于滅菌的培養(yǎng)皿中,傾注約15mL45℃的亞硫酸鐵瓊脂。仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻,待其凝固后,再傾注10mL同樣的培養(yǎng)基作為隔層,于37±1℃厭氧培養(yǎng)24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落,按5條加以證實(shí);反之,則報(bào)告陰性。

4.2.2結(jié)果計(jì)算

4.2.2.1計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度得到的陽(yáng)性反應(yīng)管數(shù)。

4.2.2.2利用MPN表,由陽(yáng)性管數(shù)估算每克(毫升)試樣中亞硫酸鹽還原梭菌最近似值。結(jié)果報(bào)告如下:估計(jì)亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(mL)。

5.證實(shí)試驗(yàn)

5.1形態(tài)觀察

  取皰肉培養(yǎng)物涂片,鏡檢,作革蘭氏染色,檢查培養(yǎng)物細(xì)菌形態(tài)。亞硫酸鹽還原梭菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,單個(gè)散在,成對(duì)、成小鏈狀或并列地聚堆存在。產(chǎn)芽胞時(shí),芽胞呈卵圓形或球形,位于中央、次終端或終端。

5.2過氧化氫酶試驗(yàn)

  在潔凈載玻片上滴1滴培養(yǎng)物,再滴加1-2 滴3% 的過氧化氫。

  出現(xiàn)小氣泡說(shuō)明有過氧化氫酶活性。

  亞硫酸鹽還原梭菌不形成過氧化氫酶。

 

附錄:

A1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液

  將8.5g氯化鈉和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸餾水中。調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1。分裝225 mL于250 mL廣口瓶中,121℃高壓滅菌15min。

A2 亞硫酸鐵瓊脂

  胰蛋白胨 15.0g

  大豆蛋白胨 5.0g

  酵母浸膏 5.0g

  偏重亞硫酸鈉 1.0g

  檸檬酸鐵銨 1.0g

  瓊脂 20.0g

  蒸餾水 1000g

  將各成分混勻,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH至7.6±0.1,分裝于500 mL錐形瓶中各250 mL,121℃高壓滅菌15 min。一周內(nèi)用完。

A3皰肉培養(yǎng)基

  牛肉浸液 1000 mL

  蛋白胨 30.0g

  酵母浸膏 5.0g

  磷酸二氫鈉 5.0g

  葡萄糖 3.0g

  可溶性淀粉 2.0g

  碎肉渣 適量

  取碎肉渣分裝15mm×150mm試管約2-3cm高,將上述液體培養(yǎng)基分裝至每管內(nèi)超過肉渣表面約1 cm。121℃高壓滅菌15 min。

A4 過氧化氫酶試驗(yàn)

  挑取培養(yǎng)物一接種環(huán),置于潔凈載玻片上,滴加3%過氧化氫溶液(臨用時(shí)配制)2mL,于半分鐘內(nèi)觀察發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性,不發(fā)生氣泡者為陰性。

編輯:foodadmin

 
分享:
關(guān)鍵詞: 亞硫酸鹽還原菌 亞硫酸鹽
 

 
 
推薦圖文
推薦檢驗(yàn)技術(shù)
點(diǎn)擊排行
檢驗(yàn)技術(shù)
 
 
Processed in 0.057 second(s), 13 queries, Memory 0.9 M