堿裂解法原理
在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中,細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下,大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心,可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì),質(zhì)粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。
電泳檢測:質(zhì)粒電泳一般有三條帶,分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型
DNA提取過程中各種試劑的作用及原理
溶液I—溶菌液:
溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí),溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。
2.溶液II-NaOH-SDS液:
NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是穩(wěn)定的。
但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí),就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。
在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時(shí),該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:
(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白,因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。
(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。
(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去除干凈,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。