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豬尿中克倫特羅檢測(cè)方法—酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(摘自農(nóng)牧發(fā)[2001]38號(hào))

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-12-15
核心提示:本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬尿中克倫特羅檢驗(yàn)的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬尿中克倫特羅的殘留常規(guī)快速篩選及定量檢測(cè)。

豬尿中克倫特羅檢測(cè)方法—酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

前言

克倫特羅為β—腎上腺素受體激動(dòng)藥,是一種用于人治療哮喘、支氣管痙攣的藥物。研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加克倫特羅可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高瘦肉率,特別是改進(jìn)脂肪型動(dòng)物的肉與脂肪的比例,豬飼用后生長(zhǎng)速度快,體型好,且瘦肉多、脂肪少,被當(dāng)作“瘦肉精”而成為一些飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)豬戶的“秘密武器”。但是克倫特羅進(jìn)入豬體內(nèi)后,主要分布在肝等內(nèi)臟器官,在體內(nèi)代謝的時(shí)間較長(zhǎng),容易造成藥物在組織中殘留,給消費(fèi)者帶來(lái)危害;健康的人在食用一定量的殘留有克倫特羅的豬肉或內(nèi)臟后,可能出現(xiàn)肌肉震顫、心慌、戰(zhàn)栗、惡心、代謝紊亂、呼吸急促、煩躁不安等癥狀。由于克倫特羅的性質(zhì)穩(wěn)定,能夠在豬尿中以原形排出,因此制訂豬尿中克倫特羅的檢測(cè)方法,以監(jiān)測(cè)“瘦肉精”的使用,顯得非常重要。

競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法是非常有效的篩選方法,可定量測(cè)定尿、肌肉、肝臟及牛眼中的克倫特羅。此法快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用,較易掌握推廣。

本標(biāo)準(zhǔn)由江西省農(nóng)業(yè)廳提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所負(fù)責(zé)起草。

本標(biāo)準(zhǔn)起草人:劉安南、陳文云、萬(wàn)文根、徐國(guó)茂。

豬尿中克倫特羅檢測(cè)方法—酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬尿中克倫特羅檢驗(yàn)的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬尿中克倫特羅的殘留常規(guī)快速篩選及定量檢測(cè)。

2 測(cè)定方法

2.1 原理與方法

測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板包被有克倫特羅特異性抗體的抗體,加入抗克倫特羅的特異性抗體,兩者結(jié)合被固定。標(biāo)樣或試樣中克倫特羅與酶(辣根過氧化酶)標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)抗克倫特羅的特異性抗體。通過洗滌以除去沒有與抗克倫特羅的特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原。加入酶基質(zhì)(過氧化尿素)和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺)結(jié)合到酶聯(lián)板上的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測(cè)定吸光度值。吸光度值與樣品中的克倫特羅濃度成反比。

2.2 試劑、用途及儀器、設(shè)備

競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法試劑盒可用于定量測(cè)定尿、肌肉、肝臟等中的克倫特羅。試劑盒中包括了所有檢測(cè)用的試劑,在使用前,請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書。定量分析須用微孔板酶標(biāo)儀(450nm)進(jìn)行測(cè)量。

2.2.1 克倫特羅系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(0ng/L,100 ng/L,300 ng/L,900 ng/L,2700 ng/L,8100 ng/L)

2.2.2 酶標(biāo)板

2.2.3 抗克倫特羅的特異性抗體

2.2.4 酶標(biāo)記抗原

2.2.5 緩沖溶液

2.2.6 酶基質(zhì)/發(fā)色劑

2.2.7 反應(yīng)停止液(1mol/LH2SO4)

2.2.8 微孔板酶標(biāo)儀(450nm)

2.2.9離心機(jī)

2.2.10微型振蕩器

2.2.11 微量加樣器(20μl,50μl,100μl,200μl,250μl)

3 制樣

3.1 樣品的制備

取適量新鮮或冷凍空白或供試尿液,如尿樣渾濁,則必須2000g離心10min,取上清液留用。

3.2 樣品的保存

-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?o:p>

3.3 測(cè)定

測(cè)定之前將所有試劑回升至室溫20℃—24℃,取解凍后的供試樣品,2000g離心10min,取上清液,作為供試液。

3.3.1 測(cè)定程序(室溫20℃—24℃條件下操作)

(1)將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架,標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn),記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。

(2)加入100μl稀釋后的抗體溶液到每一個(gè)微孔中底部,在室溫孵育15min。

(3)倒出孔中的液體,將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次),以保證完全除去孔中的液體,用250μl蒸餾水充入孔中,再次倒掉微孔中液體,重復(fù)操作兩遍以上。

(4)精密吸。玻μl標(biāo)準(zhǔn)溶液及處理好的樣品到各自的微孔中,標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

(5)加入100μl稀釋的酶標(biāo)記物到微孔底部,在微型震蕩器上混勻,室溫孵育30min。

(6)重復(fù)步驟(3)。

(7)加入100μl基質(zhì)/發(fā)色劑到微孔中,在微量振蕩器上充分混勻(或小心地在平面上轉(zhuǎn)動(dòng)酶標(biāo)板以充分混合),并在室溫暗處孵育15min。

(8)加入100μl反應(yīng)停止液到微孔中,混勻。在60min內(nèi)450nm處以空氣為空白測(cè)定吸光度值。

3.3.2 結(jié)果判定和表述

按下式計(jì)算百分吸光度值:

百分吸光度值=B/B0×100%

式中:B—為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值;

B0—為零標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度值;

以X軸為標(biāo)準(zhǔn)溶液中克倫特羅濃度(ng/L)的自然對(duì)數(shù),Y軸為百分吸光度值,在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出供試樣品中克倫特羅的濃度(ng/L)。也可以用專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件求出供試樣品中克倫特羅的濃度。

檢測(cè)結(jié)果小于1000ng/L時(shí)判為未檢出,大于或等于1000ng/Lg時(shí)判為可疑,需要復(fù)檢后再確定。復(fù)檢后小于或等于1000ng/L為未檢出,大于1000ng/L為陽(yáng)性。尿液稀釋系數(shù)為1。

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關(guān)鍵詞: 克倫特羅
 

 
 
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