實驗?zāi)康模后w外檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用。用于驗證兩個已知蛋白的相互作用,或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。
實驗原理:利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST(Glutathione S transferase)融合,融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH(Glutathione)親和結(jié)合。因此,當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復(fù)合物混合時就可被吸附而分離。
試劑:NaCl, KCl,Na2HPO4,KH2PO4,Triton-100,IPTG(Merck分裝),PMSF(Amersco),Cocktaier(Merck 539134),Immobilized Glutathione(PIERCE 15160)
實驗操作程序:
材料及試劑
探針蛋白與GST融合的原核蛋白,裂解的細胞蛋白,或者組織蛋白提取物
細胞蛋白裂解液,洗脫液:
PBS及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl: 8g
KCl: 0.2g
Na2HPO4: 1.44g
KH2PO4: 0.24g
加入800ml蒸餾水,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,最后加蒸餾水定容至1L即可,高溫高壓滅菌!4℃保存?zhèn)溆茫?/div>
PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作濃度0.1-1mM,這里使用1mM,儲存濃度100mM,將0.174g PMSF溶于10ml無水乙醇混勻即可!保持于-20℃或者4℃
(以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達蛋白B相互作用)
1:原核融合蛋白A的獲得
1.1:將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì);D(zhuǎn)BL21(DE3)菌株
1.2:挑取單個克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里,37℃培養(yǎng)過夜
1.3:將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中,37℃,225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右,加入適當(dāng)濃度的IPTG,在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間(誘導(dǎo)條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整),6000g,10分鐘,4℃離心收集細菌,去盡上清,將菌體至于-20℃放置O/N
1.4:室溫凍融菌體,馬上置于冰上,每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF),吹打混勻
1.5:冰上超聲破碎,開2秒,停9秒,總40-60分鐘。至裂解液充分清涼
1.6:11000rpm,15分鐘,4℃離心分離上清, -80℃保存?zhèn)溆?/div>
2:真核融合蛋白B的獲得
2.1:將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白(如HA,或者myc)的真核表達載體上,進行細胞轉(zhuǎn)染
3:48小時后,取適量融合蛋白GST-A冰上凍融
4:取50-70ulGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中,用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次,將凍融融合蛋白GST-A與之混勻,4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時。
5:PBS+1%Triton-100洗3次,PBS洗3次。留取20ul( PBS+Beads)作Offer。
6:同時,裂解真核融合蛋白B,去盡培養(yǎng)基,用PBS(RT)洗一次,加入300ul裂解液(以6well為例,PBS+1%Triton-100+ Cocktaier),4℃放置30分鐘。
7:吹打收集至1.5mlEP管,超聲破碎。13000rpm,15分鐘,4℃離心取上清。
8:BCA蛋白定量(optional)留取20ul做Offer,其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中,用PBS補足液體到600ul左右,以便蛋白之間能充分結(jié)合!4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N9:PBS+1%Triton-100洗3次,PBS洗3次。
10:40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白,煮沸3分鐘,高速離心,Run –SDS PAGE做Western Blot檢測。用HA或者myc Blot。
編輯:songjiajie2010
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關(guān)鍵詞:
GST-pulldown操作流程