微生物組測(cè)序--環(huán)境類樣本取樣方法
1.土壤
1.1 普通土壤
取樣容器:1.5-50ml離心管
送樣量:擴(kuò)增子重量≥2g;宏基因組重量≥5g;
1)根據(jù)研究設(shè)計(jì)選擇具有代表性的土壤;
2)采樣所用工具、塑料袋或其他物品都要事先滅菌,或用采取的土壤擦拭;
3)取 5-10cm處土壤,多點(diǎn)采取重量相當(dāng)?shù)耐寥肋M(jìn)行混勻,去除雜質(zhì)后再取一定量土壤裝入無(wú)菌管,每個(gè)樣品取樣2-10g;
4)密封后用大體積干冰運(yùn)輸,且要保證我方在收到樣品開(kāi)箱檢驗(yàn)時(shí)有足夠的干冰剩余。
注意事項(xiàng):為防止交叉污染,不建議使用自封袋取樣。
1.2 根際土壤
取樣容器:1.5ml-50ml離心管
送樣量:擴(kuò)增子重量≥2g;宏基因組重量≥5g;
1)使用的工器具要事先消毒滅菌處理;
2)采集20cm深的根際土壤于50mL的無(wú)菌管里,迅速放在液氮里凍存;
3)用20目的篩子過(guò)篩,去除植物根、動(dòng)物殘骸以及其他雜質(zhì)后分裝到無(wú)菌離心管里,每管3~5g,密封后立即-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/span>
2. 植物組織
送樣量:擴(kuò)增子重量≥1g;宏基因組重量≥2g;
1)大田或野外獲取的材料;
2)取材后需用70%酒精將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈,吸干;
3)液氮速凍后,放入預(yù)冷的50ml離心管或是封口袋中,用大體積干冰運(yùn)輸。
注意事項(xiàng):優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣;根,莖,果實(shí)組織較大時(shí),切碎后送樣。
3. 植物根表面
取樣容器:1.5-50ml離心管
1)將所研究的物體放在事先滅好的無(wú)菌容器當(dāng)中;
2)加入PBS緩沖液后進(jìn)行振蕩,使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液當(dāng)中,震蕩至少2h以上;
3)直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過(guò)濾之后再進(jìn)行DNA的提取。
PBS濃度和PH有要求:濃度是用1x的,PH值是7.4的,一般買回來(lái)的PBS是10x的,我們會(huì)稀釋到1x。
注意事項(xiàng):建議優(yōu)先使用超聲波洗滌。
4. 植物內(nèi)生菌
送樣量:擴(kuò)增子干重≥1g;宏基因組干重≥2g;
1)根據(jù)研究目的選取對(duì)應(yīng)的新鮮植物組織;
2)依次用70%無(wú)水乙醇浸泡40s,再用2.5%次氯酸鈉浸泡10min,每100ml 2.5%次氯酸鈉加一滴吐溫80;
3)無(wú)菌水清洗2-3次,-80℃保存。
5. 水體
取樣容器:1.5-50ml離心管
送樣量:擴(kuò)增子直徑3-4cm濾膜1-2張;宏基因組直徑3-4cm濾膜1-2張;
1)研究目的進(jìn)行確定水體的取樣深度和范圍;
2)采樣后進(jìn)行濾膜過(guò)濾,選擇合適孔徑的濾膜,對(duì)于澄清水體或者略渾濁水體,選用0.22μm或者0.45μm的濾膜,取樣體積大于5L;對(duì)于渾濁水體,建議先用大孔徑的濾膜過(guò)濾一遍,再用小孔徑的濾膜過(guò)濾;
3)水體泥樣的采集提供大于5g樣本;
4)用大體積干冰運(yùn)輸,且要保證我方在收到樣品開(kāi)箱檢驗(yàn)時(shí)有足夠的干冰剩余。
注意事項(xiàng):擴(kuò)增子項(xiàng)目將3-5L水體過(guò)濾到1-2張濾膜(0.22或0.45um)后裝入到離心管中;宏基因組項(xiàng)目將30-50L水體過(guò)濾到1-2張濾膜(0.22或0.45um)后裝入到離心管中。
6. 污泥、海洋沉積樣本
1)活性污泥樣本取自活性污泥裝置中,一般取樣量大于20ml,將其置于無(wú)菌管中,建議立即提取后-80℃保存;
2)海洋沉積樣本根據(jù)研究目的進(jìn)行取樣,一般建議取1kg以上的沉積物裝入塑料袋中,低溫運(yùn)輸并盡快進(jìn)行提取-80℃保存。
注意:活性污泥樣本等一般建議及時(shí)提取,樣本體積較大,長(zhǎng)時(shí)間-80℃保存,一方面儲(chǔ)存不便,另一方面凍融提取也比較困難,加大了實(shí)驗(yàn)工作量及難度。建議提取后保存DNA即可。
7. 空氣
1)抽取針對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡目諝馕㈩w粒,用不同孔徑大小的無(wú)菌濾膜篩選目的顆粒(將含顆粒過(guò)濾膜裝入無(wú)菌鋁箔內(nèi),密封在-80℃長(zhǎng)期保存);
2)截取適量大小過(guò)濾膜,置于含有1xPBS 緩沖液的50ml離心管;在4℃條件下,加速度離心2h;
3)溫和旋渦處理,0.2μm的Supor 200 PES Membrance Disc Filter 過(guò)濾紙重懸液。
注意:由于樣本特殊,微生物含量較少,建議多保管備份保存。