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菌種保藏的方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2016-10-31  來源:網(wǎng)絡(luò)
核心提示:菌種是國家重要的生物資源,鑒于其自身的遺傳性和變異性,在菌種保藏過程中,如何降低菌種的衰亡速度,防止雜菌污染,保持菌種遺傳性狀不變異,使優(yōu)良高產(chǎn)菌株長期在生產(chǎn)中應(yīng)用,成為食用菌領(lǐng)域一項重要的課題。為適應(yīng)群眾性生產(chǎn)的需要,為適應(yīng)群眾性生產(chǎn)的需要,本文介紹了幾種簡單易行、實用效果好的菌種保藏方法。
 
    菌種是國家重要的生物資源,鑒于其自身的遺傳性和變異性,在菌種保藏過程中,如何降低菌種的衰亡速度,防止雜菌污染,保持菌種遺傳性狀不變異,使優(yōu)良高產(chǎn)菌株長期在生產(chǎn)中應(yīng)用,成為食用菌領(lǐng)域一項重要的課題。為適應(yīng)群眾性生產(chǎn)的需要,為適應(yīng)群眾性生產(chǎn)的需要,本文介紹了幾種簡單易行、實用效果好的菌種保藏方法。

一、菌種保藏基本原理

    通過低溫、干燥、缺氧和饑餓等手段來達(dá)到最大限度降低菌絲體的生理代謝。首先要挑選優(yōu)良純菌種,包括菌絲體和它們的孢子;其次,根據(jù)其生理、生化特點,人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件,抑制微生物的代謝作用,使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài),從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的性狀,防止變異。

二、 菌種保藏的方法

試管斜面菌種系列保存方法

    1、低溫定期移植保藏法

    將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上,適溫培養(yǎng),當(dāng)菌絲健壯地長滿斜面時取出,放在3~5℃低溫干燥處或4℃冰箱中保藏,每隔3~6個月移植轉(zhuǎn)管1次,具體應(yīng)根據(jù)菌種特性決定。保藏時要注意環(huán)境濕度不能太高,以防霉菌通過棉塞進(jìn)入管內(nèi)。因此,若用棉塞,可用干凈的塑料薄膜或牛皮紙包扎棉塞,也可用無菌的白膠塞,并用石蠟涂封,即可減少污染的機(jī)會,也可防止培養(yǎng)基干燥。除草菇外,大多食用菌菌種都能采用此法保藏。

    2、液體石蠟保藏法

    取化學(xué)純液體石蠟裝于三角瓶中高壓滅菌后,放入40℃恒溫箱中,蒸發(fā)其中水分,至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上,28~30℃下培養(yǎng)2~3d,證明無雜菌生長方可使用。然后將母種接在斜面培養(yǎng)基上,當(dāng)菌絲在斜面上生長豐滿后,將液體石蠟注在斜面上,注入量以高出斜面1cm為宜,使菌種與空氣隔絕,降低其新陳代謝能力。管口用滅過菌的白膠塞塞緊,并用石蠟涂封,直立放在室內(nèi)干燥處或冰箱內(nèi)保藏。一般可保存1年以上,在低溫下保藏時間還可延長。使用時從斜面上挑取菌絲少許,移接到新鮮斜面培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)即可。由于菌絲體沾有液體石蠟而影響其生長,需再經(jīng)1次移接才能恢復(fù)正常生長。

    3、白膠塞封口保存法

    選擇與試管口徑相符的白膠塞,用0.2%煤酚皂溶液洗滌,浸泡在酒精內(nèi)待用。當(dāng)試管斜面長滿菌絲后,在無菌條件下拔去棉塞,取浸泡的白膠塞1個,通過火焰迅速塞入試管口內(nèi),并用石蠟熔封。此法能達(dá)到與石蠟油封存相似的效果。用該法保存菌種可存活1~3年,但以每年移植1次為好。

   4、蒸餾水保藏法

    將8成熟試管菌種放在接種箱內(nèi),注入蒸餾水,將培養(yǎng)基斜面全部淹沒至管口2cm。管口用白膠塞塞緊,并用石蠟涂封,常溫下置于陰涼處立放,可以保藏1年左右。

非斜面固體菌種系列保存法

    1、麥麩保藏法

    將麥麩和水按0.80∶1充分拌勻后,裝入試管高壓滅菌,經(jīng)無菌檢查合格后接種,適溫下培養(yǎng)至菌絲體發(fā)育好后,將試管放入真空干燥器內(nèi),用真空泵將麥麩培養(yǎng)基內(nèi)水分抽干,然后移入盛有硅膠的干燥器內(nèi),用凡士林密封在常溫下保存,可保藏3~5年。

    2、麥粒保藏法

    取優(yōu)質(zhì)小麥,淘洗后浸入20℃水中5h,撈出稍晾干,裝入試管,占管深1/3,高壓滅菌后趁熱搖散,冷卻后接入菌絲體,適溫培養(yǎng)至菌絲長滿基質(zhì)后用石蠟封棉塞,置于冰箱或20℃以下干燥處,可保藏1~2年。

    3、木屑保藏法

    將闊葉樹木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏粉1%,混合后加水拌勻,裝入試管滅菌后,接入斜面菌種,在適溫下培養(yǎng),待菌絲長至試管2/3時用石蠟封棉塞,置低溫或常溫下保藏,一般可保藏1~ 2年。

    4、稻草粉保存草菇菌種

    草菇斜面菌種在2~4℃下保存2d便失去生活力,室溫下保存又因斜面培養(yǎng)基失水太快影響菌種存活。用稻草粉保存草菇菌種有其獨特的優(yōu)越性。其配方為稻草粉75%、麥麩22%、石膏粉1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%、適量的水拌勻調(diào)濕。裝入試管高壓滅菌后按常規(guī)接種培養(yǎng),當(dāng)菌絲長到試管2/3時,管口棉塞用石蠟熔封。常溫下保存至次年,不影響其活力和種性。

液體系列菌種保存法

    1、生理鹽水保藏法

    將待保藏的菌種接入馬鈴薯培養(yǎng)液中,在250mL三角形瓶中裝60mL培養(yǎng)液,振蕩培養(yǎng)或每天搖動5~10次,培養(yǎng)5~7d,然后將形成的菌絲球用無菌吸管吸入裝有5mL無菌生理鹽水試管中,每管移入4~5個菌絲球,塞上無菌白膠塞,用石蠟涂封,置低溫下可保藏1~2年。

    2、營養(yǎng)液保存法

    營養(yǎng)液的配方為馬鈴薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、硫酸銨微量。每支試管內(nèi)裝5mL,滅菌后用無菌吸管吸取生理鹽水保藏法深層培養(yǎng)的菌絲球4~5個于試管中,10~25℃的室溫下保存,可存活2~3年,其保存效果優(yōu)于生理鹽水保存法。不影響菌株形成子實體的能力。

    3、無菌水保存法

    先將培養(yǎng)好的斜面菌種切成小塊,連同培養(yǎng)基移入盛有適量無菌蒸餾水的試管中,然后用白膠塞封口,在20℃左右的室溫下保存?纱婊1~2年。也可用磷酸緩沖液做保存液,其緩沖液的pH值視各保存菌株生長的酸堿度而定。該法操作簡便易行。

利用孢子保存菌種系列方法

    1、濾紙片保藏法

    取白色(收集深色孢子)或黑色(收集白色孢子)濾紙,剪成4.0cm×0.8cm的小紙條,平鋪在培養(yǎng)皿中用紙包裹進(jìn)行滅菌。采用鉤懸法收集孢子,讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中,白膠塞封口,再將保藏試管放入干燥器中1~2d,除去濾紙水分,然后低溫保藏。保存期可達(dá)2~10年。

    2、沙土管保藏法

    取河沙用水浸泡洗滌數(shù)次,過60目篩除去粗粒,加用1%稀鹽酸煮沸30min,以除去其中的有機(jī)質(zhì),再用水沖洗至pH值達(dá)到中性,烘干備用。同時取非耕作層的瘦黃土或紅土,用水反復(fù)沖洗至中性,烘干碾細(xì),過100目篩,將處理好的沙與土以2~4∶1混勻,然后分裝小試管內(nèi),每管裝0.5g,高壓滅菌(1.5kg/cm2)3次,再干熱滅菌(160℃,2h)1次,待無菌檢驗合格后方可使用。將已形成孢子的斜面菌種,在無菌條件下注入無菌水3mL,刮菌苔,制成菌懸液,再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中,以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內(nèi),接上真空泵抽氣至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48h內(nèi)完成,以免孢子發(fā)芽。制備好的沙土管石蠟封口,在低溫下可保藏2~10年。

    此外,還有甘油保藏法、枝條保藏法、超低溫液氮保藏法、冷凍真空干燥法等。菌種保藏方法雖多,但也各有利弊。其中低溫定期移植保藏法雖然簡單易行,不需特殊設(shè)備,但需幾個月轉(zhuǎn)管1次,轉(zhuǎn)管的次數(shù)多了,變異的可能性就增大,易造成菌種衰退。

    近年來人們找到一種目前認(rèn)為最有效廣譜安全的保藏方法——超低溫液氮保藏法,ATCC 用這種方法保藏雙孢蘑菇,9年后菌種仍保持穩(wěn)定,是目前國際上公認(rèn)為較為理想的菌種保藏方法。但需要液氮保藏罐設(shè)備,且液氮來源有限,費用高,只有少數(shù)科研院所使用,無法推廣。此外,還有冷凍真空干燥法,此法一般可保存10年以上,但成本較高。

三、菌種保藏效果的鑒定

    常用指標(biāo)是菌株的存活率和接種物成活率。為確切判斷菌株在保藏后是否發(fā)生變異,還須從以下4個方面進(jìn)行觀察和測定:①生物學(xué)特征,如菌絲形態(tài)、顏色等;②對基質(zhì)分解能力,如走菌、吃料速度等;③遺傳特征,如相關(guān)酶的酶譜、酶活力等;④生產(chǎn)出菇能力,包括產(chǎn)量、質(zhì)量。通過經(jīng)常檢驗,以確保不出現(xiàn)任何退化跡象的菌株取得菇農(nóng)的信賴。通過保藏菌種的效果鑒定,可以對保藏方法加以改善,使保藏體系更加完善。

編輯:foodnews

 
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