激光掃描共聚焦顯微鏡與圖像半定量分析相比,具有以下優(yōu)點:
1.更精細、精確度更高。激光掃描共聚焦顯微鏡對免疫熒光組織化學染色樣品做定量分析時,利用激光聚焦和系統(tǒng)軟件分析對組織進行深層掃描,不破壞組織細胞結構,可深層次準確定位并精確定量。而一般圖像分析只是以熒光灰度的差別變化進行半定量分析。
2.激光掃描共聚焦顯微鏡一般有兩個以上不同波長的激光管,只要將標本標記上不同波長的熒光,就可以在同一張切片上同時分析兩種或更多不同指標的變化,并比較它們之間的比值變化,精確而又方便,這一特點是一般圖像分析無法比擬的。
3.激光掃描共聚焦顯微鏡可根據(jù)需要提供純熒光、白光以及熒光與白光合成圖像等多種圖像,遠遠優(yōu)于一般圖像分析。
4.以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標本,用石蠟切片在普通熒光顯微鏡下觀察,常因背景非特異性熒光過強影響觀察結果。而石蠟標本來源廣泛,適用于回顧性研究。激光掃描共聚焦顯微鏡可掃描石蠟切片的熒光染色,可避免因背景非特異性熒光過強而影響觀察結果,從而可獲得清晰圖像,這也是激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢所在。
激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項
一、制備高特異性和高效價的熒光抗體
標本只有在用熒光探針標記的前提下才能進行共聚焦顯微鏡檢測.制備高特異性和高效價的熒光抗體是檢測的關鍵。這就要求選用高質量的熒光素和高特異性與高效價的免疫血清。同時還要對熒光抗體進行質量鑒定,主要是進行特異性和敏感性鑒定。
二、標本制作要求
1.標本厚度 組織切片或其他標本不能太厚,否則激發(fā)光多數(shù)消耗在標本下部,而物鏡觀察的上部不能被充分激發(fā)。
2.載玻片 載玻片要光潔,無自發(fā)熒光;載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間,太厚會吸收較多的光,不能使激發(fā)光在標本上聚焦。
3.封固劑 甘油必須無色透明,無自發(fā)熒光。由于熒光在pH 8.5~9.5時較亮,不易很快退去,常用甘油加入0.5mol/lpH 9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液封片。
三、定量研究的要求
1.隨機性
(1)在感興趣區(qū)域內(nèi)隨機抽樣,不能主觀地選擇一些便于定量的“理想切片”,這種“理想切片”不能代表所要研究的整體區(qū)域。
(2)在隨機抽取的切片上,應隨機抽取觀察視野。
(3)在隨機抽取的視野中,通過連續(xù)觀察“光學切片”,得到感興趣結構的三維定量信息。如果不能連續(xù)觀察“光學切片”,需要在Z軸方向隨機抽樣,然后作定量研究。
2.避免參照陷阱 如果獲得的資料是密度信息,當比較各組參照空間(包含待測結構的區(qū)域)的體積不同時,根據(jù)密度信息可能得出錯誤結論。因此,需要注意所謂的參照空間“陷阱”問題。