根據(jù)所使用的技術(shù)不同,實時熒光定量PCR可以分為:熒光探針和熒光染料兩種方法。
現(xiàn)將其原理簡述如下:
1. TaqMan熒光探針
TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù),其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性,切斷探針,產(chǎn)生熒光信號。PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個體化用藥分析的shou選技術(shù)平臺
2. SYBR熒光染料
在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是:
① 開始反應(yīng),當(dāng)SYBR染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光;
② DNA變性時,SYBR染料釋放出來,熒光急劇減少;
③ 在聚合延伸過程中,引物退火并形成PCR引物;
④ 聚合完成后,SYBR染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合,定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
實時熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)化學(xué)原理可以分為探針類和非探針類。探針類實時熒光定量PCR技術(shù)主要是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加;非探針類實時熒光定量PCR技術(shù)主要通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。無論是探針類實時熒光定量PCR技術(shù)還是非探針類實時熒光定量PCR技術(shù),檢測的都是擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量。但探針類實時熒光定量PCR技術(shù)增加了識別探針的具體的流程,操作的難度較大。