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PCR反應(yīng)問題解答(四)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶 (雜帶)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-07-29  來源:上海撫生實(shí)業(yè)有限公司
核心提示:4. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶 (雜帶)(1)引物用量偏大,引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。(2)循環(huán)的次數(shù)過多。適

4. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶 (雜帶)

(1)引物用量偏大,引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

(2)循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量,減少循環(huán)次數(shù)。

(3)酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好,應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

(4)退火溫度偏低,退火及延伸時(shí)間偏長。應(yīng)提高退火溫度,減少變性與延伸時(shí)間,也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

(5)樣品處理不當(dāng)。

(6)Mg2+濃度偏高,因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。

(7)若為PCR試劑盒,也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。

(8)復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。

(9)反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并徹底混勻。

(10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

(11)引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。

(12)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

(13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。

編輯:songjiajie2010

 
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