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PCR | 條帶出現(xiàn)拖尾或非特異性擴(kuò)增如何解決?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-09-23  來源:Super Lab公眾號
核心提示:1.非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的


1.非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:

一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。

二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

其對策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

2.片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。

其原因往往由于

(1)酶量過多或酶的質(zhì)量差

(2)dNTP濃度過高

(3)Mg2+濃度過高

(4)退火溫度過低

(5)循環(huán)次數(shù)過多

其對策有:

(1)減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶

(2)減少dNTP的濃度

(3)適當(dāng)降低Mg2+濃度

(4)增加模板量

(5)減少循環(huán)次數(shù)

編輯:songjiajie2010

 
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