（一）、前期做好充足的準備工作：

根據(jù)國家標準，提前準備好要用的平板計數(shù)瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等。

（二）、樣品接受：

收到樣品后，確認樣品包裝是否完好，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力驗證平臺進行確認。

（三）、樣品處理：

按照作業(yè)指導書操作（一定要仔細閱讀作業(yè)指導書）看看是幾個樣品及實驗記錄要求。一般實驗室收到的是干粉樣品或者是固體樣品等。假如收到的是干粉樣品，那么第一步就要水化。

樣品水化步驟（建議）：一般能力驗證樣品以國體粉末形式發(fā)放，以液體（CFU/mL）形式出報告。樣品水化前一定要認真、仔細閱讀作業(yè)指導書，看看用多少稀釋液水化，水化后作為原液還是多大濃度的樣品來記錄。

（四）、實驗前準備：

a、能力驗證時最好在超潔凈臺或者生物安全柜里操作，這樣就要把超潔凈臺或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實驗環(huán)境無菌。

b、提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺上。

（五）、實驗操作：

a、稀釋

將樣品從冰箱中取出達到室溫后開啟使用，在超潔凈臺或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化后吸入無菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進行洗滌并全部轉入無菌瓶或袋中。（具體公需多少稀釋液要看作業(yè)指導書說明）

洗滌轉移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進行均質混勻，一般作為原液立刻進行接種；再取25mL到225mL稀釋液中均質混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1mL無菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無菌平皿中。

注意事項：

a.一般能力驗證的樣品添加的菌落濃度都比較高，檢測過程一定要多做幾個稀釋度，每個稀釋度多做幾個平板平行。

b.梯度稀釋：是關鍵步驟，必須盡可能地減少誤差（新手建議渦旋混勻，渦旋時間不宜過長，長時間離心力等作用下，微生物細胞可能死亡）。

c、傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

d、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20mL不等，一般以15mL較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。

e、傾注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

f、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時要盡可能放在中央部位，然后應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。

g、瓊脂瓶放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現(xiàn)平皿不凝固現(xiàn)象；拿出傾注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

h、冷卻的過程不要著急，冷卻充分后再倒置放進培養(yǎng)箱培養(yǎng)，放置的時候要盡量避免放到風機口處，每摞不要超過6個平皿。

i、檢驗結束后所有的稀釋液樣品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏，以備必須再用（一旦第二天發(fā)現(xiàn)實驗做錯了，在做一次實驗，死馬當活馬醫(yī)）。