平板劃線分離法:是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面，通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。

為方便劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有分區(qū)劃線法和連續(xù)劃線法兩種（如圖1， A、B）。

圖1

2）分區(qū)劃線法

取菌、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似。

分區(qū)劃線法分離時平板分四個區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。其中第4區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第4區(qū)內(nèi)劃線與1、2、3區(qū)線條相接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120°左右。

先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3~5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉(zhuǎn)動60~70°，右手把接種環(huán)上多余菌體燒死，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉(zhuǎn)動約60~70°，同樣依次在3、4區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。

該法主要用于單個菌落的純培養(yǎng)、保存菌種或觀察細(xì)菌的某些特性。

（1）左手平托兩支試管，拇指按住試管的底部。外側(cè)一支試管是斜面上長有菌苔的菌種試管，內(nèi)側(cè)一支是待接的空白斜面，兩支試管的斜面同時向上。用右手將試管塞旋松，以便在接種時容易拔出。

（2）右手拿接種環(huán)（如握毛筆一樣），在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌．

（3）將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指和掌心將兩支試管的試管塞一并夾住拔出，試管塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。注意不得將試管塞隨意丟于桌上受到沾污，試管口切勿燒得過燙以免炸裂。

（4）將已灼燒的接種環(huán)伸入外側(cè)的菌種試管內(nèi)。先把接種環(huán)的先端觸及無菌苔的培養(yǎng)基上使其冷卻（如果操作迅速，此時接種環(huán)尚未完全冷卻）。再根據(jù)需要用接種環(huán)沾取一定量的菌苔，注意勿刮破培養(yǎng)基。將沾有菌苔的接種環(huán)迅速抽出試管，注意勿使接種環(huán)碰到管壁或管口上。

（5）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管的底部，輕輕向上劃線（直線或曲線，根據(jù)需要確定），勿劃破培養(yǎng)基表面。

（6）接好種的斜面試管口再次過火焰，試管塞底部過火焰后立即塞入試管內(nèi)。

（7）將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌。先在內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，會使菌體爆濺，造成污染。

（8）放下環(huán)后，再將試管塞旋緊，在試管外面上方距試管口2～3cm處貼上標(biāo)簽。

斜面接種方法及無菌操作過程如下具體操作過程見圖3。

圖3

用接種針經(jīng)火焰滅菌，沾取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后將挑起菌落的接種針平行于管壁插入瓊脂斜面底部、沿著原接種線將針拔出、燒試管塞和試管口、塞上試管塞，再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉。要做到手穩(wěn)、動作輕巧快速。見下圖4。（a:垂直接種法，b：水平接種法）

圖4