答:新柱活化,實際上是一個平衡的過程,除了用流動相平衡外,有時候還必須用所測樣品對新柱進(jìn)行平衡,特別是測定分子量比較高的多肽,尤其重要。因為分子量高的物質(zhì)分子,擴散速度慢,平衡所需時間也相應(yīng)較長。具體平衡方式也很簡單,多進(jìn)幾次樣品,直到峰面積和保留時間穩(wěn)定,再進(jìn)行正式進(jìn)樣測定。
如果要加快平衡時間,把前面用來平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大,或者不等洗脫完成,連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測物對新柱平衡,目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。
測定多肽,一般采用什么柱子?流動相是乙腈和水,還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽,應(yīng)該怎么選擇柱子?
答:分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測定,也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。
氨基柱在進(jìn)酸性樣品時,很傷柱子,如使用一段時間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復(fù)?
答:氨基柱測酸性樣品,應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負(fù)電荷的氨基官能團質(zhì)子化,導(dǎo)致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。建議:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%。
色譜柱的技術(shù)都有哪些?比如封尾等,這些技術(shù)在應(yīng)用時都體現(xiàn)在哪里?
答:色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),填料技術(shù)自不待言,填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床,更多是一門藝術(shù),需要經(jīng)驗積累。
國內(nèi)和國外想比,我認(rèn)為色譜柱的差距在于:國內(nèi)公司以前都不會自己開發(fā)填料,一般買國外現(xiàn)成填料裝柱,買到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因為裝柱歷史短,經(jīng)驗積累少,裝柱工藝也沒有完全達(dá)到國外水平。另外,對色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠,國產(chǎn)的還不過關(guān),在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產(chǎn)品相比,差距很大。
色譜柱技術(shù)的差距在哪里?
答:液相色譜柱裝填實際上是有一定技巧和程序,可能還有一些運氣。一般使用高壓勻漿方法裝填。也就是能讓填料在溶劑內(nèi)均勻地懸浮。然后用瞬間高壓壓實,這實際上用到了不同比例的勻漿液體,和合適的壓力。壓力太大,顆粒破碎,壓力太小,塔板數(shù)少。同時壓力需要穩(wěn)定,不然分布不均,拖尾嚴(yán)重。同時還有頭上平整程度。套上套,就可以用了。
柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來也討論過這個問題,我也拆下來清洗過,但我看到柱前段的污染更甚,于是就用刀片刮了刮,然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解決了,但使用壽命會不會減少呢?
答:柱頭污染了,就取出污染的,再裝一些填料。因為加入你刮了些填料,那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多,僅表面,可能就是一些臟物,所以,問題解決。但是今后還會有同樣問題,再掛,那么不小心刮,影響柱效。建議還是裝一個預(yù)柱。
如果柱子取下來放置一段時間,需要做什么保護嗎?
答:對一般的反相柱,也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,然后用堵頭塞緊柱兩頭,以免保存溶劑揮發(fā),應(yīng)該不需要做特殊的保護。
流動相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機理是什么?
答:《高效液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說:甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體、四氫呋喃是偶極溶劑,應(yīng)該除了極性影響,還有另外的影響因素,至于分離機理,還是比較復(fù)雜的,不能看成是個萬能方法。
關(guān)于色譜柱的填裝問題
我個人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況:
(1)國外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣到國內(nèi);
(2)國外生產(chǎn)填料,國內(nèi)填裝銷售;
(3)國內(nèi)生產(chǎn)填料,國內(nèi)填裝銷售。
一般情況下,第1種情況賣的最貴,也質(zhì)量最好!可是如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話,那么填裝上國內(nèi)也跟不上去嗎?為什么換在國內(nèi)填裝就會出現(xiàn)或多或少的一些小問題呢?
答:國內(nèi)填裝會出現(xiàn)質(zhì)量小問題,和國內(nèi)目前普遍做事沒有國外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧。如果工藝技術(shù)上沒有問題,又能制訂并切實執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施,國內(nèi)填裝和國外填裝并無區(qū)別。
國產(chǎn)色譜柱在市場上占有比例如何?
國內(nèi)色譜柱市場還沒有人進(jìn)行過科學(xué)統(tǒng)計,連一年色譜柱銷售總量也眾說紛云,更別說國內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了。我估計是占30%左右吧。
預(yù)柱或保護柱用還是不用的問題!原來分析中藥品種時,我一直都是用保護柱。但來到新公司后,發(fā)現(xiàn)大家都沒有使用,幾個實驗室連保護柱都沒找到一個,也就是說大家從來都沒有用過。后來問一個老員工,說是有可能影響藥品分析。想問:安裝保護柱后會影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭孢類的抗生素。
答:應(yīng)該這樣說,加上保護柱,肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞,肯定有害于分離度和柱效,因為保護柱中間有著死體積的存在。但是如果保護柱接得好,并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換,分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。頭孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,有些原料藥,可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱(中間是個篩板),制劑的話,如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動相鹽分比較大,那還是最好配個保護柱。
用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水經(jīng)常出現(xiàn);蜻M(jìn)氣泡這是什么原因?
答:水/甲醇比例在55:45時,黏度和柱壓有個極大值。50:50接近了這個極值,柱壓是比較高的,但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑,你這個實例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱?系統(tǒng)壓力高,可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng),停機也應(yīng)該是因為氣泡進(jìn)入壓力下降的原因,可考慮更換液體通量更大的過濾頭。 想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法,是不連檢測器嗎? 答:反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中。因為有污染物反沖出來,當(dāng)然不連檢測器,出液端直接接到廢液瓶就可以。
網(wǎng)上對柱子是否可以反沖一直有爭論,那什么樣的柱子可以反沖,什么不可以。反沖后是正著用,還是反著用。具體到各型號柱子不僅是ODS柱,其他如正向柱、氨基柱、離子交換柱等最好都有解釋。
答:一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖,只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖,不過目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,反沖后還是正著用比較好,以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是:正向使用,反向沖洗。