蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的天然高分子化合物。必須從食物中攝取的氨基酸稱為必需氨基酸(EAA),人體所需的必需氨基酸有賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及蘇氨酸,此外,組氨酸對嬰兒生長也是必需的。
凱氏定氮法原理
蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出,而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨,與硫酸結合生成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后,再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)(乳及乳制品換算系數(shù)為6.38),即為蛋白質(zhì)的含量。
(1)消化
濃硫酸具有脫水性,使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性,可將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳,硫酸則被還原為二氧化硫。二氧化硫使氮還原為氨,本身則被氧化為三氧化硫,氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。
蛋白質(zhì)+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
消化時加入的硫酸銅是作催化劑,以加速分解反應,還可以加入氧化汞、氧化銅等作催化劑,為防止汞的污染,通常用硫酸銅較多。如果以汞或汞化合物作催化劑,則消化和加堿后,形成汞氨化合物。此化合物在蒸餾時不能完全分解,在這種情況下,必須加入鋅粉或硫代硫酸鈉或硫化鈉,使汞氨化合物分解。
C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2
有機物消化完后,溶液具有清澈的硫酸銅的藍綠色,同時硫酸銅在下一步蒸餾時可作堿性反應的指示劑。
在消化過程中添加硫酸鉀,與硫酸反應生成硫酸氫鉀,是為了提高溶液沸點,從而提高反應溫度,加速反應過程。此外,也可以加硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點。
在消化過程中,隨著硫酸的不斷分解、水分的不斷蒸發(fā),硫酸鉀的濃度逐漸增大,沸點升高,加速了對有機物的分解作用。
加入過氧化氫,是利用其氧化性,以加快反應速度:
2H2O2→O2+2H2O
(2)蒸餾
在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性,硫酸銨在堿性條件下釋放出氨,通過加熱蒸餾,氨隨水蒸氣蒸出:
(NH4)2SO4+2NaOH →2NH3+Na2SO4+2H2O
(3)吸收
加熱蒸餾時放出的氨可用硼酸溶液進行吸收。
2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O
(4)滴定
待吸收完全后,用硫酸或鹽酸標準溶液滴定生成的硼酸銨,屬于鹽類的滴定。硼酸為極弱的酸,在滴定中并不影響所用指示劑的變色反應。
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3
(5)計算
根據(jù)硫酸或鹽酸溶液消耗的體積,計算總氮含量,再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)(乳及乳制品換算系數(shù)為6.38),即為粗蛋白的含量。
注意事項
(1)加入樣品及試劑時,避免黏附在瓶頸上。
(2)加入硫酸鉀的作用:提高硫酸的沸點(338℃),增進反應速度。但過多的硫酸鉀會造成沸點太高。生成的硫酸銨在513℃會分解,故此加入硫酸鉀的量一定要準確。
(3)加入硫酸銅的作用:催化劑,使氧化作用加速。
(4)消化時,采用長頸圓底凱氏燒瓶斜支于電爐上,其操作必須在通風櫥中進行,并使全部樣品浸泡在消化液中,防止樣品黏附在瓶頸上部,以致消化不完全;在消化過程中,樣品炭化變黑,產(chǎn)生泡沫,這時要減小火力。勿使黑色物質(zhì)上升到凱氏燒瓶頸部,待消化液均勻沸騰后,再加大火力,直至消化液黑褐色消失呈淡藍色透明為止。如樣品含脂肪較多時,應適當增加硫酸量,用硫酸量少時,過多的硫酸鉀會形成硫酸氫鉀而不與氨作用,導致氨損失。
(5)蒸餾裝置要安裝平穩(wěn)、牢固、嚴密,各連接部分不能漏氣。水蒸氣發(fā)生器裝水不可太滿,加玻璃珠以防爆沸。
(6)蒸餾時,蒸汽要發(fā)生均勻、充足,不得;饠嗥駝t蒸餾瓶內(nèi)壓力降低會發(fā)生倒吸;避免瓶中的液體發(fā)泡沖出進入接收瓶。加堿量要足,動作要快,防止氨損失。冷凝管出口一定要浸入吸收液中,防止氨揮發(fā)損失。
(7)蒸餾結束后,應先將吸收液離開冷凝管口,以免發(fā)生倒吸。判斷是否蒸餾完全,可用pH試紙測試冷凝管口的冷凝液而確定。
常見問題解答
一、消化過程中容易沾壁怎么辦?消化后定氮瓶內(nèi)有黑色殘留物怎么辦?
解答:稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部,避免因樣品未消化完全而造成結果偏低。消化過程中如果發(fā)生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物,可以在消化較完全時搖動定氮瓶,把定氮瓶肚上的黑色物質(zhì)搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗,戴上防燙手套,手掌緊握瓶頸,向前后側甩,使瓶內(nèi)液體呈半旋轉(zhuǎn)半振蕩狀態(tài),注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎?
解答:硫酸鉀的作用是提高溶液沸點,從而加快有機物分解。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑?
解答:硫酸銅的作用有三個,分別為:
①催化作用:加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑:使液體呈現(xiàn)藍綠色澄清透明狀態(tài)。
③蒸餾時堿性反應的指示劑:產(chǎn)生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎?
解答:混合指示劑必須臨用時混合。
五、蒸餾的時取下錐形瓶需要用洗瓶沖洗嗎?不沖洗會有誤差嗎?
解答:需要沖洗冷凝管下端以防止產(chǎn)生結果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作?
解答:可以將蒸餾裝置連接好后,在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水,打開電爐加熱,觀察有無氣泡產(chǎn)生。
七、硼酸可以多加嗎?
解答:不可以。按國標的要求正確操作,10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液,能否換濃度高的鹽酸溶液滴定?
解答:不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質(zhì)含量較高的樣品可以適當減少稱樣量,或合理范圍內(nèi)減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什么?
解答:試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎么換算?
解答:同時含有多種蛋白質(zhì),且折算系數(shù)不相同時可以按復合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。