1.2.2.1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備:接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,35~37℃培養(yǎng)18~24小時。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-6~10-7,制成每1ml含菌數(shù) 50~100cfu的菌懸液。
1.2.2.2.白色念珠菌菌液制備:接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中,23~28℃培養(yǎng) 24~48小時;取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-6~10-7,制成每1ml含菌數(shù) 50~100cfu的菌懸液。
1.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,23~28℃培養(yǎng)5~7天,加入3~5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,吸至無菌試管內(nèi),取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-4~10-6,制成每1ml含孢子數(shù)50~100cfu的孢子懸液。
1.2.3. 供試液的制備
1.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備
◆稀釋劑:pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
◆液體供試品:供試品10ml置錐形瓶中,加入90ml稀釋劑,混勻,作為供試液(1:10)。
◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品:稱取供試品10g置錐形瓶中,加稀釋劑至100ml,混勻后,作為供試液(1:10)。
1.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備
當供試品具有抑菌活性時,須先消除抑菌活性,其方法如下:
◆ 培養(yǎng)基稀釋法:取供試液2ml,每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿;或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿,傾注15ml的培養(yǎng)基,測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù),混勻,凝固,培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù),按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù);控制菌檢查時可加大增菌液的用量。
◆離心沉淀集菌法:取一定量的供試液,3000轉/分離心20分鐘(供試液如有沉淀,先以500轉/分鐘離心5分鐘,取全部上清液再離心),棄去上清液,留底部集菌液約2ml,加稀釋液補至原量。
◆薄膜過濾法:取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液,過濾,沖洗,按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。
◆ 中和法:選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當?shù)膶Π被郊姿,含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸,洗必泰制劑加入聚山梨酸 80(3%)或卵磷脂(3%),鹵素中加入硫代硫酸鈉(0.1%)等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。
1.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法,取試驗用的1ml菌液(約50~100cfu)分別注入平皿中,立即傾入培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.試驗組
1.2.5.1.平皿法:取試驗可能用的稀釋級1ml供試液和50~100cfu試驗菌,分別注入平皿中,立即傾入培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法(平皿法):取試驗可能用的稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中,每個平皿再注入50~100cfu試驗菌,分別注入平皿中,立即傾入培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌落數(shù)。
1.2.5.3薄膜過濾法:取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入50~100cfu試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。
1.2.5.4. 離心沉淀集菌法:取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液,如供試液含許多藥渣,先以500轉/分鐘離心3~5分鐘,取全部上清液,再以3000轉/分離心 20分鐘,取下面1ml液體,并用稀釋劑洗滌管底,將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。
1.2.6. 供試品對照組
取規(guī)定量供試液,按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)(方法和試驗組相同)。
1.2.7.稀釋劑對照組
若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時,應增加稀釋劑對照組,用稀釋劑代替供試品,加入試驗菌,使最終濃度為每1ml 供試液含50~100cfu,按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。
1.2.8.回收率計算
1.2.8.1.試驗組回收率計算
試驗組的菌回收率= 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數(shù)×100%菌液組的平均菌落數(shù)
1.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算
試驗組的菌回收率= 稀釋劑對照組平均菌落數(shù) ×100%菌液組的平均菌落數(shù)
計數(shù)方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
1.2.8.3. 結果判斷
在3次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)≥70%。若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù);若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%,應采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證,使試驗組菌回收率大于70%。