當建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應(yīng)進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。

1.3.1.驗證用菌株 

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】

金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】

乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學特性。  

1.3.2.菌液制備 

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時；分別取培養(yǎng)液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。   

1.3.3. 陰性菌對照組

設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。  

1.3.4.試驗組

1.3.4.1.常規(guī)法

◆ 大腸埃希菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。

◆大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規(guī)定檢查。

◆沙門氏菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。

◆銅綠假單胞菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。 

◆ 金黃色葡萄球菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。

1.3.4.2. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強的樣品。

1.3.4.3. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 

1.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。 

1.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。  

1.3.5.結(jié)果判斷 

至少應(yīng)進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。 

2.驗證的實施 

2.1細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。

2.2.分析數(shù)據(jù)，綜合整個驗證過程，得出驗證結(jié)論。 

2.3.驗證過程中發(fā)生的異常情況，按照《偏差處理程序》進行處理。 

3.相關(guān)文件

《微生物限度檢查SOP》

4.再驗證

4.1.藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。 

4.2.驗證時檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。