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流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

基本原理
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,目前早期識別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca 依賴的磷脂結(jié)合蛋白,最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨特的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此,可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。


試劑與儀器
 孵育緩沖液:10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2
 標(biāo)記液:將FITC- Annexin V(寶靈曼公司產(chǎn)品)和PI加入到孵育緩沖液中,終濃度均為1ug/ml
 流式細(xì)胞儀


實驗步驟
1. 細(xì)胞收集:懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中,每樣本細(xì)胞數(shù)為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。
2. 用孵育緩沖液洗滌1次,500~1000r/min離心5min。
3. 用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞,室溫下避光孵育10~15min。
4. 500~1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。
5. 加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動。
6. 流式細(xì)胞儀分析:流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560nm的濾器檢測PI。
7. 結(jié)果判斷:凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性,壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光,而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此,在細(xì)胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正;罴(xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細(xì)胞,即壞死細(xì)胞,為(FITC /PI );而右下象限為凋亡細(xì)胞,顯現(xiàn)(FITC /PI-)。

 
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