2．掌握永久制片的制作過(guò)程，為研究植物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。
3．學(xué)會(huì)植物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的比較研究方法。
二、實(shí)驗(yàn)器具與試劑
1．器具
石蠟切片機(jī)、烘箱、顯微鏡、染色缸、小培養(yǎng)皿、鑷子、毛筆、吸水紙、紗布、載玻片、蓋玻片等。
2．試劑
10%番紅水溶液、0.5%固綠（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸餾水、甘油、中性樹(shù)膠等。
三、實(shí)驗(yàn)材料
幼嫩植物各部分，根據(jù)季節(jié)選擇材料。
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法
石蠟切片法是顯微技術(shù)上最重要、最常用的一種方法。它是把材料封埋在石蠟里面，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，可以切出很薄的切片。凡是精細(xì)的工結(jié)構(gòu)，大都用石蠟切片。全都過(guò)程如下：
1．固定 2．洗滌 3．脫水與硬化 4．脫酒精 2．封埋 6．切片
7．粘片 8．脫蠟 9．染色 10．脫水 11. 透明 12．膠封
（一）固定
1．固定的意義：固定就是用藥品把細(xì)胞殺死，使細(xì)胞的原生質(zhì)凝固，死后不發(fā)生變化，盡可能保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)以供我們觀察。良好的固定劑，應(yīng)是穿透力強(qiáng)，使細(xì)胞立刻致死，原生質(zhì)全部凝固；不發(fā)生任何變形，增強(qiáng)折光率，并且不妨礙染色。
2．固定液的種類：固定液的種類很多，根據(jù)配制成分可劃分為：
(1) 簡(jiǎn)單固定液：以一種化學(xué)藥品配制的固定液。常用的簡(jiǎn)單固定液有：
A．酒精即乙醇，用作固定液，常用純酒精或95％酒精。酒精穿透力強(qiáng)，固定時(shí)間常在1小時(shí)以內(nèi)。高濃度酒精有使材料收縮的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，絕不可用純酒精。酒精為還原劑，不能與鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等氧化劑配合。酒精可使核酸，蛋白質(zhì)及肝醣等發(fā)生沉淀，但能溶解脂肪及擬脂。
B．福爾馬林即甲醛，具強(qiáng)烈刺激性的氣味，純凈的甲醛，為無(wú)色透明液體。固定用的濃度為4-10％甲醛也是強(qiáng)還原劑。不能與鉻酸、鋨酸等氧化劑配合。經(jīng)固定后，材料變硬，通常不引起皺縮，但隨后經(jīng)過(guò)他種藥劑處理時(shí)，就每每出現(xiàn)皺縮。所以甲醛一般不單獨(dú)作固定，而與其他液體混合使用。
C．醋酸：為無(wú)色透明的液體，刺激性極強(qiáng)，冷則凝結(jié)成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以與水和酒精配成各種比例的溶液，所用濃度為0.2～5％，也常與其他固定劑配合使用。醋酸穿透性很強(qiáng)，單獨(dú)使用，有使原生質(zhì)膨脹的作用，故常與酒精，甲醛等合用，醋酸為固定染色體的優(yōu)良固定液，因此固定染色體的固定液中，幾乎都含有醋酸。
(2) 混合固定液：由幾種藥劑，適量配制而成。常用的有下列幾種：
A、F.A.A固定液(又稱萬(wàn)能固定液)：
[用途]這個(gè)固定液在植物研究上，應(yīng)用最多，為植物組織最常用的固定液。固定時(shí)間，不受限制，短為24小時(shí)，長(zhǎng)可延至數(shù)月或數(shù)年。野外工作，非常便利。并且固定的材料，不妨礙染色，但對(duì)染色體的固定不佳。材料固定后，用50％酒精洗滌數(shù)次。
[配法]
50％或70％酒精 90毫升
冰醋酸 5毫升
福爾馬林 5毫升
柔軟材料用50％酒精，堅(jiān)硬材料用70％酒精配制。
B、卡爾諾氏(Carnoy's)固定液
[用途]此液作組織細(xì)胞的固定，有極快的滲透力，固定根尖和花藥只需40-60分鐘。固定后用95％酒精沖洗，在組織不能立即處理時(shí)，需轉(zhuǎn)入70％酒精中保存。配法有兩種：
C．納瓦興(Navaschjn's)固定液
[用途]此液在植物制片上應(yīng)用甚廣，是細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)上一種優(yōu)良的固定液。此液原來(lái)的配方已很少應(yīng)用，現(xiàn)所用的都是改良液，且種類很多，如材料較柔嫩，含水量較多，可用配方I、Ⅱ；材料較堅(jiān)硬，含水量較少，可用Ⅳ、V 配方，其中配方Ⅱ?qū)χ参锱咛W(xué)制片特別適用。為了使用方便，常分別配成甲、乙兩種基液，用時(shí)臨時(shí)等量配合。固定時(shí)間為12-24小時(shí)，固定后用70％酒精洗滌數(shù)次。
(二)洗滌
材料固定后，藥劑繼續(xù)留在組織中，易使組織破壞，必須用水或酒精洗去。用什么去洗，可根據(jù)三條原則：
1．凡用水溶液配制的固定液，特別是含有鉻酸、重鉻酸鉀的固定液，一律用水洗。
2．凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。
3．如固定液中含有苦味酸．在70％酒清中停留稍久時(shí)，可除去黃色。如用升汞固定的材料，在洗滌時(shí)，須加碘液，可除去汞的結(jié)晶。
（三）脫水與硬化
材料洗滌后，其中含水，水與石蠟不能混合，必須洗去。去水用酒精，材料由水入酒精中，不能操之過(guò)急，須由低度酒精漸至高度酒精。通常由30％、50％、70％、80％、90％，每次須經(jīng)半小時(shí)，材料大的，時(shí)間須延長(zhǎng)。若暫時(shí)不能埋蠟、材料可放在70％酒精中保存，經(jīng)久不壞。在高度酒精中，不能過(guò)久．因酒精能使材料硬化，過(guò)久則材料由硬而脆，切時(shí)易于粉碎。
（四）脫酒精
材料脫水后，材料中全含酒精，酒精與蠟也不能混合，仍須除去。脫酒精通常用二甲苯，材料由酒精入二甲苯，最好也漸次進(jìn)行，先經(jīng)純酒精二甲苯混合液，再入純二甲苯中，純二甲苯須換一、二次才行。時(shí)間每次約半小時(shí)。二甲苯不僅脫去酒精，并且透明，所以又叫透明劑。
（五）埋蠟
埋蠟是把材料封埋在石蠟里面，便于切片。一方面材料太小太軟封在石蠟中，石蠟硬度適中，靠石蠟支持，才能切成薄片。另一方面，材料封埋后，不僅材料外面包著蠟，材料內(nèi)面所有空隙也都充滿著蠟。這樣，材料的各部分都能保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)與位置，切片不致發(fā)生破裂或其他變形。
所用石蠟，質(zhì)地必須純凈，溶點(diǎn)通常在48～56℃這個(gè)范圍內(nèi)，以52℃的石蠟用得更多。在材料不硬，天氣不熱時(shí)，宜用較低熔點(diǎn)的蠟。材料硬，天氣熱的情形下，宜用高溶點(diǎn)的蠟。
石蠟選定后，將石蠟切成小塊，置瓷皿中加熱溶蠟，待石蠟近于全部熔化時(shí)，置于溫箱中。在進(jìn)行封埋的全部過(guò)程中，石蠟的溫度，總以高于溶點(diǎn)2℃為宜，過(guò)低石蠟?zāi)蹋^(guò)高傷害材料。
材料脫酒精后，要進(jìn)行浸蠟，再進(jìn)行埋蠟。浸蠟也宜于漸次進(jìn)行，一般先用石蠟和二甲苯的混合液浸蠟，再用純石蠟換一、二次，每次的時(shí)間，視材料大小而定，通常每次半小時(shí)，材料大，時(shí)間必須加長(zhǎng)。在浸蠟的過(guò)程中，須注意溫度，不能超過(guò)2℃以上。浸蠟后，須將材料封埋在蠟塊中，通常以磅紙折成紙盒(如圖所示)。在盒內(nèi)底上，用軟鉛筆反書(shū)材料及日期等，然后把蠟倒入盒內(nèi)，將材料移入紙盒中，依將所要切的方向，妥善排列，再以兩手平持紙盒，移至冷水中，用口在蠟面上吹氣，促其凝結(jié)，待蠟面凝成簿層時(shí)，將紙盒全部沉入。水冷凝后，將紙撕去，即獲蠟塊，至此埋蠟完成。
折紙盒按下列順序折疊：
(1) 折AA'及BB'；
(2) 折CC'及DD'；
(3) 折CE'與AE'、向外夾出EE'。同樣折出FF'，GG'及HH'；
(4) 使CE'E與E'IE兩三角形相疊，并沿E'C和EI重疊的折痕向后轉(zhuǎn)折。同樣折其余三只角；
(5)折RIJF向外，同樣折出GKLH，即折成所需的紙盒。
（六）切片
石蠟切片，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)。一個(gè)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)，可分三個(gè)部分，一個(gè)是安裝切片刀的部分，有調(diào)節(jié)刀片斜度和固著刀片的螺旋。一個(gè)是安裝材料的部分，也有螺旋可以調(diào)節(jié)材料的位置。另一個(gè)是操縱在旋轉(zhuǎn)中向前推進(jìn)的部分，控制著切片的厚薄，是比較重要而復(fù)雜的部分。
切片步驟：
1．先將冷凝的蠟塊，切成小塊，粘固在小木頭上。
2．安裝切片刀，刀的斜度，非常重要，最好先切除的蠟塊試刀，以確定刀的斜度，一經(jīng)調(diào)度適合后，就不要隨便變動(dòng)，以免每次試刀的麻煩。
3．修整蠟塊，刀片斜度調(diào)好后，將刀片移近蠟塊，使小蠟塊的下邊與刀鋒平行，然后把它固定，再轉(zhuǎn)下蠟塊．呈矩形才行。只有平整的蠟塊，才能切出平整的蠟帶。
4．最后根據(jù)需要，調(diào)整控制切片厚度的機(jī)制。調(diào)度后，把它固定下來(lái)。上述四步驟完成后，就可進(jìn)行切片，將切出的蠟帶，平展于盒內(nèi)以供粘片。
（七）粘片
材料切成薄片后，須將切片粘在玻璃片上，加熱展開(kāi)，這叫粘片。所用載玻片必須清潔才能使用。粘片時(shí)，需把膠液(或稱粘貼劑)置簿玻片上，再取切片，浮置膠液上，然后置烘片臺(tái)上，使切片展開(kāi)燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度。最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時(shí)以記號(hào)筆在玻片上編號(hào)，放入溫箱中烘干，溫度30～40℃約1小時(shí)即干。常用的膠液有下列三種：
(1) 明膠液：這是粘片最常用的膠液，簡(jiǎn)便優(yōu)良，配法是100毫升純水中，加明膠4毫克，加熱熔化，過(guò)濾即得。
(2) 梅氏蛋白質(zhì)：
雞蛋清 50ml
甘 油 50m1
水楊酸納 1g
用蛋白與甘油攪拌，同時(shí)加入水楊酸納，調(diào)勻過(guò)濾，應(yīng)用時(shí)以濾液15滴，放入純水50毫升中即得。
(3) Land氏液：
阿拉伯膠 1克
重鉻酸鉀 0.2克
純 水 100毫升
（八）脫蠟
玻片烘干后，須將蠟脫去，才能染色，脫蠟用二甲苯，再經(jīng)酒精入水中，而后染色，其順序如下：
二甲苯→1/2 二甲苯十1/2純酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色
以上各級(jí)約需5～10分鐘。
（九）染色
染色的方法很多，視研究目的加以選擇�，F(xiàn)就研究植物組織和研究細(xì)胞分裂常用的兩種染色方法介紹如下：
1．番紅與固綠色法
番紅用l％的水溶液，固綠用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步驟如下：
討論和注意點(diǎn)：
(1) 用番紅和固綠這個(gè)組合染成的切片，木化、栓化和角質(zhì)的細(xì)胞壁，被番紅染成鮮紅色，纖維素的細(xì)胞璧，被固綠成綠色。就維管束來(lái)講，木質(zhì)部染紅，韌皮部染綠，區(qū)別極清楚。
(2) 在50％酒精中脫色，需經(jīng)實(shí)踐，如脫色不夠，綠色難得染好，脫色太過(guò)分，做出來(lái)的切片，紅色太淡，甚至于全是綠色，失掉了二色染法的用意。
(3) 染色時(shí)間，不是絕對(duì)的，常因材料種類，切片的厚簿而不同，在沒(méi)有把握時(shí)，最好選用少數(shù)材料試染，試染成功后，再依次大批染色。
2．海氏鐵礬—蘇木精染色法：
海氏鐵礬—蘇木精染色法的特點(diǎn)，是在染蘇木精以前，用鐵明礬做媒染劑，在染蘇木精以后，又用鐵明礬液鑒定(脫色或分色)。
所用鐵明礬液，為2～4％的水溶液，此液須在用前數(shù)日臨時(shí)配制。配成后不能見(jiàn)光，須置暗處，或用有色玻瓶裝。也不能保存太久，大約二月內(nèi)可用，用時(shí)，每次更換。
所用蘇木精液，為0.5％的水溶液。此液配成后，須經(jīng)1～2月，待它氧化成熟以后才能應(yīng)用，故必須先配制。蘇木精在水中溶解很慢，約需10日才能完全溶解，若需用不急，可直接用蒸餾水配制。若想加速溶解，可先用酒精溶解，再加入蒸餾水。
蘇木精 0.5克
酒 精 10毫升
蒸餾水 90毫升
染色步驟如下：
此染色法在細(xì)胞學(xué)及胚胎學(xué)制片上應(yīng)用很廣，是顯示細(xì)胞一般結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分裂的優(yōu)良染色液，染色結(jié)果可使染色體呈蘭黑一—紫色，細(xì)胞質(zhì)染成淺蘭色或淺灰色。在染色過(guò)程中所需注意的是：① 分色后，用水洗凈鐵礬液，最好用流水，如無(wú)流水，須多更換水。若沖洗不凈，將來(lái)繼續(xù)褪色。② 在鐵礬液中分色，須時(shí)常取出在顯微鏡下檢查，到細(xì)胞質(zhì)的染色很淡即止。
（十）脫水、透明、膠封
脫水用酒精，由低濃度酒精至高濃度酒精依次進(jìn)行，最后入純酒精更換一次，用二甲苯透明，用樹(shù)膠封片，其步驟與前面所述永久制片相同。