Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測(cè)對(duì)象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。
(1)RNA經(jīng)變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。轉(zhuǎn)移方法與轉(zhuǎn)移DNA的方法相似。
(2)轉(zhuǎn)移完畢后 ,以6×SSC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小時(shí)。
(4) 用下列兩種溶液之一進(jìn)行預(yù)雜交，時(shí)間為1-2小時(shí)。若于42℃進(jìn)行,應(yīng)采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS；若于68℃進(jìn)行,應(yīng)采用:6×SSC，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern雜交）。
(5) 在預(yù)雜交液中加入變性的放射性標(biāo)記探針,如欲檢測(cè)低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應(yīng)大于2×108 cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時(shí)。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室溫洗膜20分鐘,隨后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分鐘。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)進(jìn)行放射自顯影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小時(shí)。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘,部分水解RNA并提高轉(zhuǎn)移效率。浸泡后用經(jīng)DEPC處理的水淋洗凝膠,并用20×SSC浸泡凝膠45分鐘。然后再轉(zhuǎn)移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛酰RNA,雜交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜所用方法，與RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA轉(zhuǎn)移前需用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次,以除去甲醛。當(dāng)使用尼龍膜雜交時(shí)注意，有些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰RNA，同時(shí)可部分水解RNA，并提高較長(zhǎng)RNA分子(>2.3kb)轉(zhuǎn)移的速度和效率。此外，堿可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰RNA在堿性條件下轉(zhuǎn)移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行，但轉(zhuǎn)移緩沖液為7.5mmol/LNaOH，轉(zhuǎn)移結(jié)束后(4.5-6.0小時(shí))，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室溫晾干。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA探針時(shí)尤為嚴(yán)重。將濾膜長(zhǎng)時(shí)間置于高濃度的堿性溶液中,會(huì)導(dǎo)致雜交背景明顯升高,可通過(guò)提高預(yù)雜交和雜交步驟中有關(guān)阻斷試劑的量來(lái)予以解決。
(6)如用中性緩沖液進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移結(jié)束后,將晾干的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2小時(shí),或者254nm波長(zhǎng)的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優(yōu)先使用,因?yàn)槟承┡?hào)的帶正電荷的尼龍膜經(jīng)此處理后,雜交信號(hào)可以增強(qiáng)。然而為獲得最佳效果,務(wù)必確保尼龍膜不被過(guò)度照射，適度照射可促進(jìn)RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu),而過(guò)度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合于尼龍膜表面,導(dǎo)致雜交信號(hào)減弱。
