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FISH步驟

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06
1、脫蠟:
1)二甲苯脫蠟3次,每次5min;
2)100%酒精兩次,每次2min;
3)移出酒精,斜置切片,標記末段向下,空氣干燥。
2、蛋白酶處理:
1)每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi),搖動直到酶溶解。
2) 37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3) ×SSC在室溫下漂洗切片3次,每次1min。
4)梯度酒精脫水(-20℃預(yù)冷)。
3、變性:
1)每一個立式染色缸配制40ml變性溶液;
2)78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸;
3)78℃孵育8min;
4) 即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi),每缸2min;
5)空氣干燥。
4、雜交:
1)準備探針;
2)取一個較大的濕盒,交叉放置切片;
3)滴10μl探針在切片的組織上,加蓋玻片;
4)蓋上濕盒蓋,37℃孵育12h~16h。
雜交后的水洗:
5)鑷子小心去除蓋玻片;
6)43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
7)2×SSC(37℃)洗兩次,每次10min;
8)切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測,勿使切片干燥。
檢測:
9)從1×PBS中取出切片,除去過多的水分,避免標本干燥。把切片放入濕盒內(nèi),同時處理4張切片。
10)每張切片使用30μl~60μl羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素,室溫下孵育20min;
11)去掉塑料蓋膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
擴增:
12)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
13)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
14)去掉塑料蓋膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min;
15)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
16)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
17)1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
5、細胞核染色:
1)張切片加10μl~20μl DAPI,覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5ml;
2)盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。
 
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