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在液相色譜中，給你一個樣品，怎么來選擇流動相將樣品分開呢？在什么情況下使用緩沖溶液呢？緩沖溶液的選擇有什么技術(shù)要求？
一、緩沖液的選擇
當(dāng)分離酸性或堿性樣品時，通常需加入一定量的緩沖鹽，緩沖鹽的濃度及類型如何確定？
1、緩沖鹽的濃度
緩沖鹽的濃度對離子樣品保留值的影響通常較小，濃度一般為10-50mmol/l。
2、緩沖鹽的類型
緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動相中水相的pH和離子強度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。
通常在pH2到4條件下，保留時間對pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強。一般緩沖鹽溶液的pH值應(yīng)在其pka±1的范圍內(nèi).
3、緩沖鹽的離子締合
如酸性條件下分離堿性化合物，加入NH4CL，堿性物質(zhì)離子與反離子相互作用的平衡導(dǎo)致它們相互的溶劑化并形成相關(guān)復(fù)合物離子，在低pH時，堿性化合物被完成質(zhì)子化，溶液陰離子（如CL-）在流動相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性，導(dǎo)致樣品保留時間增加，當(dāng)鹽濃度大于50mM時，保留時間略有下降[4]，這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。
4、緩沖鹽的其它性質(zhì)
緩沖鹽的溶解性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性（可能與設(shè)備、樣品和或色譜柱發(fā)生作用）對某些分離也很重要。如磷酸鹽，在含有高濃度有機相（70%以上），可能會析出；一些緩沖劑放置即降解，貯存或長期使用后其紫外吸收會增加（如：TFA、三乙胺）；一些緩沖鹽能通過形成離子對，對樣品發(fā)生作用（如三氟醋酸緩沖劑與陽離子樣品，三乙胺與陰離子樣品等）；揮發(fā)性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應(yīng)用于蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜的檢測。
二、峰拖尾常見原因及應(yīng)對方法
1、HPLC體系中存在過大的死體積，導(dǎo)致一部分的分析物在這些空間里滯留過長的時間而表現(xiàn)為拖尾。
這種拖尾是對于每一個色譜峰都存在的，因此當(dāng)出現(xiàn)每個色譜峰都拖尾時，有可能就是這個原因。以前就遇到過這個問題，儀器增加了一個模塊，死體積增加，峰又胖又拖尾。
應(yīng)對方法：更換更短、內(nèi)徑更小的管路；檢查部件的連接是否緊密；檢查保護柱或者在線過濾器的安裝是否合適（這個尤為常見）；換到表現(xiàn)正常的儀器排查下是否是色譜柱的原因等。
2、在HPLC柱中存在兩種或以上的吸附位點，這兩個位點與分析物作用的非均一性。
有的固定相表面存在大量低能量吸附位點，這種吸附位點與分析物的作用是非選擇性的，包括色散或者簡單的極性作用。有的固定相表面同時存在少量的高能吸附位點，這種吸附位點與分析物的作用是有選擇性或者特異性的，包括氫鍵作用、離子交換作用和螯合作用等，不同吸附位點作用力不同導(dǎo)致峰拖尾。
應(yīng)對方法：通過改變流動相條件（如添加劑，pH值等）或者針對性地更換色譜柱來減少拖尾。
3、色譜柱過載。
當(dāng)樣品進(jìn)樣量過大，使色譜柱出現(xiàn)過載時，色譜峰也會表現(xiàn)出拖尾。特別是帶電荷的化合物時，當(dāng)保留在固定相上時會因為靜電排斥而大大降低其載樣量。
應(yīng)對方法：可以通過降低進(jìn)樣量觀察峰形是否改善來確定是否是過載導(dǎo)致的峰拖尾。對于由于帶電荷的化合物，可以通過調(diào)節(jié)pH值（比如把化合物調(diào)至中性狀態(tài)）或者加入離子對試劑來改善峰形。
4、色譜柱柱頭污染或篩板部分堵塞。
這樣導(dǎo)致分析物分子中的一部分滯留時間增加從而導(dǎo)致拖尾。
應(yīng)對方法：這種情況一般表現(xiàn)為色譜圖的所有色譜峰都出現(xiàn)拖尾，可以通過更換同款色譜柱來排查或者反接色譜柱（如果確定色譜柱可以反接）觀察峰形是否改善來判斷。
文章（文字）來源：實驗室儀器分析
