高效液相色譜法(HPLC)具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保、石化、食品、化工等行業(yè),是現(xiàn)在分離分析的重要方法,本文著重介紹HPLC的工作原理、基本組成及高效液相色譜名詞術(shù)語(yǔ),使新學(xué)者快速了解高效液相色譜知識(shí),在日常操作中理論與實(shí)踐結(jié)合,確保HPLC的高效運(yùn)行、快速分析。
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HPLC工作原理
100多年前俄國(guó)植物學(xué)家Tswett(茨維特) 他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶,Tswett用希臘語(yǔ)chroma(色)和graphos(譜)描述他的實(shí)驗(yàn)方法,即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)。
Tswett(茨維特)色譜實(shí)驗(yàn)
色譜法是通過(guò)是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離,色譜法的本質(zhì)是分離分析方法。
色譜分離原理
兩相中的一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),一相是流動(dòng)的,叫作流動(dòng)相(Mobile Phase),又叫洗脫劑。用液體作為流動(dòng)相的,即為液相色譜(Liquid Chromatography, LC)。
HPLC為High Performance Liquid Chromatography的縮寫(xiě)(High高、Performance性能、Liquid液體的、Performance 色譜),是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段,具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點(diǎn)。
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HPLC分類(lèi)
按固定相和流動(dòng)相的相對(duì)極性分為正相色譜(NormalPhaseChromatography)和反相色譜(Reversed Phase Chromatography)。
正相色譜:固定相的極性大于流動(dòng)相。
反相色譜:固定相的極性小于流動(dòng)相。
有機(jī)化合物極性是指分子間作用力(靜電引力、偶極力、色散力、氫鍵力)綜合表現(xiàn)的一種表述。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法
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反相色譜法
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固定相極性
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高~中
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中~低
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流動(dòng)相極性
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低~中
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中~高
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組分洗脫次序
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極性小先洗出
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極性大先洗出
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從上表可看出,當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒(méi)有明顯的界線(如氨基鍵合固定相)。
按分離過(guò)程的機(jī)理分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和體積排除色譜。
吸附色譜(Absorption Chromatography):根據(jù)樣品組分對(duì)活性固定相表面吸附親和力的不同實(shí)現(xiàn)分離。
分配色譜(Partition Chromatography):分離基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度(分配系數(shù))不同。
離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography):根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡(jiǎn)稱離子色譜(IC)。
體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography):分為GPC和GFC。
GPC(Gel Permeation Chromatography凝膠滲透色譜又稱尺寸排阻色譜):固定相是疏水性凝膠,流動(dòng)相是水或緩沖溶液-有機(jī)溶劑。
GFC(Gel Filtration Chromatography凝膠過(guò)濾色譜又稱水系凝膠色譜):固定相是親水性凝膠,流動(dòng)相是水或緩沖溶液。
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HPLC組成
HPLC由溶劑輸送系統(tǒng)(脫氣機(jī)、高壓泵等)、進(jìn)樣系統(tǒng)(定量泵、六通閥、定量環(huán)、進(jìn)樣針等)、分離系統(tǒng)(色譜柱等)、檢測(cè)系統(tǒng)(檢測(cè)器等)、記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
高壓輸液泵:將流動(dòng)相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng),具有有足夠的壓力,輸出流量恒定、可調(diào),輸出壓力平穩(wěn),泵室體積小,泵體抗腐蝕、耐酸等特點(diǎn)。
壓力平穩(wěn)、流速恒定是HPLC系統(tǒng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好的前提條件,多數(shù)的HPLC故障、色譜數(shù)據(jù)異常均會(huì)表現(xiàn)出壓力異常,如偏高、偏低、波動(dòng)大等,在日常使用中需要特別關(guān)注壓力變化。
在線脫氣機(jī):四元低壓系統(tǒng)屬于泵前混合,由于在常壓下混合,極易產(chǎn)生氣泡,必須配有在線脫氣機(jī),并要求流動(dòng)相使用前進(jìn)行脫氣,流動(dòng)相脫氣得目的如下:
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使色譜泵輸液均勻準(zhǔn)確,減小脈動(dòng)。
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提高保留時(shí)間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。
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防止氣泡引起尖峰。
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使基線穩(wěn)定,提高信噪比。
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降低溶劑的紫外吸收本底。
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減少死體積。
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防止填料氧化。
進(jìn)樣系統(tǒng):分為手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng), 主要由定量環(huán)、六通閥、進(jìn)樣針等部件組成。手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)的定量環(huán)用于準(zhǔn)確定量,分為5μl、10μl、20μl等,需要根據(jù)不同進(jìn)樣量選擇合適的定量環(huán);自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)儀器自帶定量環(huán)多為100μl,如進(jìn)樣量大于定量環(huán)體積需咨詢相應(yīng)儀器工程師更換定量環(huán)及計(jì)量泵等,六通閥是最理想的進(jìn)樣部件,由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成,通過(guò)閥切換保證恒定的流速,下圖為六通閥不同狀態(tài)流路示意圖。
分析液相多數(shù)配自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)具有進(jìn)樣精度高、重現(xiàn)性好、可用于大量樣品分析等特點(diǎn)。
分離系統(tǒng):包括色譜注、柱溫箱,連接管線等部件。
色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm,柱長(zhǎng)為10~50cm,柱形多為直形,內(nèi)部充滿3~10 μm高效微粒固定相,根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求需要選擇不同填料、不同規(guī)格的色譜柱。
柱溫箱:保證分離系統(tǒng)的溫度恒定,降低溫度波動(dòng)對(duì)色譜基線、保留時(shí)間及色譜分離的影響,包括普通柱溫箱及帶有冷卻功能的柱溫箱,普通柱溫箱可以根據(jù)方法需求設(shè)定高于室溫的溫度(一般應(yīng)高于室溫5℃以上),降低柱壓或是改善色譜分離,帶有冷卻功能的柱溫箱可以升高柱溫外,還可以設(shè)定低于室溫的溫度,預(yù)防穩(wěn)定性差樣品的降解,各品牌柱溫箱的控溫范圍略有差別,需要通過(guò)相應(yīng)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或咨詢客服了解。
需要特別注意的是有些品牌的柱溫箱是沒(méi)有配置預(yù)加熱模塊的,對(duì)于溫度敏感的樣品需要在柱前連接一段管線,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)加熱,管線長(zhǎng)度及內(nèi)徑需適當(dāng),盡量降低死體積。
檢測(cè)器:包括紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器(UVD)、熒光檢測(cè)器(FD)、蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)、示差折光檢測(cè)器(RID)、電化學(xué)檢測(cè)器(ED)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CD)、質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)等類(lèi)型,其技術(shù)要求為靈敏度高、噪音低、線形范圍寬、響應(yīng)快。
紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器(UVD):波長(zhǎng)范圍190~800mm,190~400mm為紫外區(qū)域,氘燈,400~800mm為可見(jiàn)光區(qū)域,鎢燈。其特點(diǎn)為靈敏度高,最小檢測(cè)濃度10-9g/ml,線性范圍寬,對(duì)溫度和流速不敏感,可進(jìn)行梯度洗脫,應(yīng)用范圍廣。適用于帶有共軛基團(tuán)的化合物,為最常用的檢測(cè)器。
熒光檢測(cè)器(FD):氘燈作激發(fā)光源,波長(zhǎng)范圍250~600nm。其特點(diǎn)為靈敏度更高,檢測(cè)限10-12~10-13g/ml(靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)),選擇性好,對(duì)溫度和流速不敏感,可進(jìn)行梯度洗脫,所需試樣量少,適于痕量分析,應(yīng)用于組分吸收一定波長(zhǎng)紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì),且熒光強(qiáng)度與濃度成正比。
蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD):是一種通用型的檢測(cè)器,可檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品,而不需要樣品含有發(fā)色基團(tuán)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器靈敏度比示差折光檢測(cè)器高,對(duì)溫度變化不敏感,基線穩(wěn)定,適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。被廣泛應(yīng)用于碳水化合物、類(lèi)脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測(cè)。其主要缺點(diǎn)為響應(yīng)值與濃度不呈線性,需取響應(yīng)值的對(duì)數(shù)與濃度計(jì)算線性。
示差折光檢測(cè)器(RID):是一種連續(xù)檢測(cè)樣品流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值的通用型檢測(cè)器,其優(yōu)點(diǎn)為對(duì)糖類(lèi)檢測(cè)靈敏度較高,其檢測(cè)限可達(dá)10-8g/ml;穩(wěn)定性好,操作方便,缺點(diǎn)該檢測(cè)器對(duì)多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低(約10-5g/ml),通常不用于痕量分析;受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響較大,不適合梯度洗脫。
質(zhì)譜檢測(cè)器(MS):將樣品中的分析物電離,不同質(zhì)量離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)中,將按其質(zhì)量和所帶的電荷比(質(zhì)荷比,m/z)進(jìn)行的分離和排序,根據(jù)質(zhì)荷比的大小和相對(duì)強(qiáng)度形成規(guī)則的質(zhì)譜,從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒別和定量分析。質(zhì)譜分析具有靈敏度高,樣品用量少,分析速度快,分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn),但流動(dòng)相中不能含有無(wú)機(jī)鹽。
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HPLC名詞術(shù)語(yǔ)
色譜圖(Chromatogram): 色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為時(shí)間。
色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)。
峰底(Peak Base):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線。
峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距離。
峰面積(Peak Area):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值。
基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動(dòng)相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)。
基線飄移(Baseline Drift):基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。
基線噪聲(N)N)(Baseline Noise):由各種因素所引起的基線波動(dòng)。
譜帶擴(kuò)展(Band Broadening):由于縱向擴(kuò)散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動(dòng)過(guò)程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象。
保留時(shí)間(tR)(Retention time):組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間。
死時(shí)間(t0)(Dead time):不被固定相滯留的組分,從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間。
保留體積(VR)(Retention volume):組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積。
死體積(V0)(Dead volume):不被固定相滯留的組分,從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積。
等度:在整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中溶劑組成保持不變,如(60:40 甲醇/水)。
梯度:在運(yùn)行過(guò)程中溶劑組成變化,漸變或臺(tái)階式變化,如100%的 H20/ 0%的MeOH到0%的H2O/100%的MeOH。
分離度:用于評(píng)價(jià)待測(cè)物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度,是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)。除另有規(guī)定外,待測(cè)物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大1.5 ,分離度的計(jì)算實(shí)例如下圖:
理論塔板數(shù)(N):分離效率的量度,用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。
拖尾因子:用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。
重復(fù)性:用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時(shí),通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%;采用內(nèi)標(biāo)法時(shí),通常配制相當(dāng)于80%、100和 120%的對(duì)照品溶液,加人規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別至少進(jìn)樣2次,計(jì)算平均校正因子,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。
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HPLC日常操作注意事項(xiàng)
選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題:
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盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相,防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。
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避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。
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試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。
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流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí),流動(dòng)相不應(yīng)有較強(qiáng)的紫外吸收,一般檢測(cè)波長(zhǎng)應(yīng)大于流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)。
泵的維護(hù)保養(yǎng):
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防止任何固體微粒進(jìn)入泵體,否則會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)缸體和單向閥,因此應(yīng)預(yù)先對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾,可采用Millipore濾膜(0.22μm或 0.45μm )等過(guò)濾。泵的入口都應(yīng)該連接砂濾棒(或片), 輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常更換。
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流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì), 含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi), 尤其是停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。分析工作結(jié)束后必須用純水充分清洗后,再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑(對(duì)于反相鍵合固定相,可以是甲醇或甲醇和水)
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泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相用完,否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)或缸體,最終產(chǎn)生漏液。
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輸液泵的工作壓力不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力,否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形,產(chǎn)生漏液。
紫外檢測(cè)器維護(hù)保養(yǎng):
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流通池進(jìn)入氣泡會(huì)干擾基線,并極難排出,應(yīng)使用充分脫氣的流動(dòng)相,以減少氣泡的產(chǎn)生。
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應(yīng)定期沖洗系統(tǒng),避免流通池干涸。
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檢測(cè)器中氘燈( 光源) 隨著使用時(shí)間的增加,氘燈強(qiáng)度降低,噪音會(huì)不斷增大,故分析前柱平衡得差不多時(shí),再打開(kāi)檢測(cè)器,分析工作結(jié)束及時(shí)關(guān)閉檢測(cè)器(頻繁開(kāi)關(guān)檢測(cè)器也會(huì)縮短檢測(cè)器壽命,一般開(kāi)啟間隔少于4小時(shí),不建議關(guān)閉檢測(cè)器)。
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塵埃在靜電的作用下容易覆蓋在光學(xué)元件上, 使光傳播效率降低,增加了光散射, 影響分析效果, 因此檢測(cè)器周?chē)沫h(huán)境應(yīng)保持清潔。
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