什么是合理的期望值?
有時(shí)候你會(huì)發(fā)現(xiàn)好像你用了大部分的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)在不停的買液相色譜柱。為什么色譜廠家不能把柱子的壽命延長(zhǎng)一些呢?實(shí)際上,在合理的維護(hù)下,柱子可以成為液相分析花費(fèi)里面很小的一部分。舉一個(gè)例子,一根典型的反相柱子的花銷在3405-4087元之間, 如果它能進(jìn)樣500-1000次,那么每一次進(jìn)樣的花費(fèi)是3.4-6.8塊錢(qián)。
盡管費(fèi)用會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)室和特定方法不同而變化,完成一次常規(guī)的進(jìn)樣分析,340塊錢(qián)的總費(fèi)用是合理的,這也可由做委托檢測(cè)業(yè)務(wù)的第三方實(shí)驗(yàn)室對(duì)類似分析的定價(jià)所確認(rèn)。
因此,我們上面談到色譜柱的花費(fèi)在總分析成本中只占1-2%,我們想方設(shè)法使柱子的壽命延長(zhǎng)一倍,即使單根柱子的成本還是很高,實(shí)際上這樣做并不能在整個(gè)分析成本上降低很多。個(gè)人的感覺(jué)是如果你用一根柱子進(jìn)了500針,那這樣就已經(jīng)很劃算了。
首先,先看一下其他幾個(gè)色譜學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)。 Ron Majors,在他的“色譜柱觀察”專欄的某期連載文章中,已經(jīng)包含了針對(duì)色譜各個(gè)方面的用戶調(diào)查結(jié)果。他有關(guān)色譜柱壽命的大部分專欄文章是在2012年發(fā)表的,將作為我們目前討論的基礎(chǔ)。圖1是基于Ron Majors 2011年用戶調(diào)查數(shù)據(jù)的餅型圖。
可以看到有回應(yīng)的調(diào)查對(duì)象中接近四分之三的進(jìn)樣壽命在500針以上,而且有近二分之一達(dá)到了至少 1000次的進(jìn)樣壽命。這個(gè)結(jié)果對(duì)我來(lái)說(shuō)是非常吃驚的,因?yàn)樗藢?duì)所有類型的色譜柱的壽命調(diào)查,不僅僅是現(xiàn)代液相中的最吃苦耐勞的用得最多的主力色譜柱,4.6×150mm,5μm反相柱,相對(duì)于其它種類色譜柱,它甚至有點(diǎn)刀槍不入的味道。
圖1 分析柱的典型進(jìn)樣次數(shù)。數(shù)據(jù)基于2011 年調(diào)查
為了看清隨著時(shí)間變化情況改變的情形,我做了一個(gè)1997年到2011年四個(gè)調(diào)查結(jié)果的比較圖,見(jiàn)圖2?梢钥吹接袔讉(gè)明顯的趨勢(shì)。
第一,我注意到灰柱,灰柱代表的是在柱子損壞之前進(jìn)樣小于1000次的百分比,從1997年的76%跌倒了2011年的53%;同時(shí)有明顯對(duì)比的是代表能進(jìn)樣1000以上的黃柱高度增加很快。在上面我有提到我把進(jìn)樣500次作為柱子使用壽命的一個(gè)平衡點(diǎn),我們可以發(fā)現(xiàn)在柱子壞之前進(jìn)樣次數(shù)達(dá)不到500次的用戶的數(shù)量明顯下降,從1997年的接近一半到2011的四分之一。
圖2 在LC柱子損壞之前進(jìn)樣次數(shù)的比較
最后我們可看到,有著可怕經(jīng)歷的用戶的數(shù)量,即那些只能做到100或者更少的進(jìn)樣次數(shù)的用戶,比例基本上沒(méi)有改變,徘徊在10%附近。
找出這種改變的原因只能是出于推測(cè),但是我很樂(lè)意做此推斷。我不認(rèn)為柱子壽命有明顯的提升是因?yàn)橹庸に嚨母倪M(jìn)。
不可否認(rèn),在某個(gè)時(shí)期,柱子塌陷,或者是柱床中有空腔形成的情況非常普遍,但是在1997年開(kāi)展調(diào)查的時(shí)間段,裝柱工藝就已經(jīng)非常成熟了,由于裝柱工藝導(dǎo)致柱子損壞的情況很少見(jiàn)。我認(rèn)為柱子壽命延長(zhǎng)的主要原因是用戶受到更好的培訓(xùn),從而對(duì)樣品前處理和柱子的物理保護(hù)更好了。
柱子的保護(hù)方法就是我想在下文著重說(shuō)明的。我同時(shí)也推斷,進(jìn)樣次數(shù)很穩(wěn)定的小于100,與其說(shuō)是柱子本身的原因,還不如說(shuō)是實(shí)驗(yàn)室操作存在問(wèn)題,或者說(shuō)是某些應(yīng)用方法本身就是“柱子終結(jié)者”。
不要未處理樣品就進(jìn)樣
在我的LC課堂中,我經(jīng)常開(kāi)玩笑的說(shuō),延長(zhǎng)柱子壽命的最好方法是不要打開(kāi)色譜柱的盒子。一旦你開(kāi)始進(jìn)樣,就開(kāi)始了柱子走向滅亡的道路。樣品有兩個(gè)主要方面可以影響色譜柱—化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)。我們把樣品中不要的化學(xué)污染物和微型顆粒清除的越好,柱子的壽命就越長(zhǎng)。
使用SPE(Solide-Phase extraction),液液萃取和其他技術(shù)來(lái)除去化學(xué)污染物是LCGC中“Sample Prep Perspectives”專欄常有這樣的文章,我就不在這里多說(shuō)了。一言以蔽之,越多的樣品前處理,越少的化學(xué)污染物進(jìn)入色譜柱,柱子壽命就越長(zhǎng)。你還得平衡一下樣品前處理費(fèi)用和它帶來(lái)的好處。
比如,你買了柱芯和試劑,并加上你投入時(shí)間的費(fèi)用,你在每個(gè)樣品上SPE的花費(fèi)會(huì)很容易超過(guò)34塊錢(qián),這是可以承受500次進(jìn)樣量的反相柱在每個(gè)樣品分析上分?jǐn)偝杀镜?倍多,這差不多需要將色譜柱進(jìn)樣次數(shù)從500次延長(zhǎng)至2500次才扯平了。
另一方面,如果沒(méi)有做過(guò)任何處理的血漿樣品直接進(jìn)樣了,柱子可能就只能進(jìn)樣10次左右。你也要考慮到當(dāng)更多的樣品處理步驟加入的時(shí)候的數(shù)據(jù)質(zhì)量。我知道,在我們的實(shí)驗(yàn)室中,這些措施可以讓我們?cè)诘蜐舛鹊臅r(shí)候收集到有用的數(shù)據(jù)并得到一致的結(jié)果,而不是比較少的前處理步驟可能得到的結(jié)果。
不論你做沒(méi)做其他前處理步驟,幾乎所有的樣品都會(huì)從樣品過(guò)濾,離心或者兩者中得到好處。樣品經(jīng)過(guò)一個(gè)一次性的過(guò)濾膜過(guò)濾來(lái)移除可能堵住柱子進(jìn)口篩板的細(xì)顆粒物。濾膜的孔徑不能大于柱子進(jìn)口篩板的孔徑。
大部分>3μm填料顆粒的柱子用2μm孔徑的篩板,3μm填料粒徑的柱子則一般用0.5μm的篩板,填料粒徑<3-μm的柱子,比如UHPLC,一般用0.2μm的進(jìn)口篩板。最常用的樣品過(guò)濾膜是0.45μm孔徑的,這個(gè)對(duì)除了亞2μm之外的其它柱子都已經(jīng)足夠,亞2μm柱子,則需用0.2μm的濾膜。
濾膜可作為預(yù)裝在一次性注射器中的柱芯,也作為96孔板的過(guò)濾板。即使這些過(guò)濾裝置一般是有效的,但我不是非常強(qiáng)烈的推薦使用。至少有4點(diǎn)使我不同意過(guò)濾樣品。
第一,樣品過(guò)濾成本比較昂貴,上一次我比較過(guò)價(jià)格,一次性購(gòu)買1000份,每份的價(jià)格都要高于3.4元,這個(gè)與柱子在每次分析中的分?jǐn)傎M(fèi)用幾乎一樣。
第二,用0.5μm濾膜過(guò)濾很慢,而0.2μm濾膜則更慢。
第三,如果你在一個(gè)監(jiān)管嚴(yán)格的環(huán)境中工作,每一個(gè)樣品的處理步驟都必須一樣,這就是說(shuō),如果你過(guò)濾了一個(gè)樣品,那么其他剩余的樣品也都要過(guò)濾,無(wú)論實(shí)際上需不需要。
最后,如果你要驗(yàn)證你的LC方法,就需要驗(yàn)證所有的過(guò)濾步驟。在過(guò)濾的過(guò)程中,樣品會(huì)有損失——如果50μL樣品經(jīng)過(guò)濾膜,得到的樣品就少于50μL。
你得證明樣品不是選擇性的損失,特別是在高濃度或者低濃度的時(shí)候。因此,我們可以看到,樣品過(guò)濾是需要花很多功夫和金錢(qián)的。但是你要是不怕麻煩和不要求成本,樣品過(guò)濾是在大部分的情況下都是能提高柱子的壽命的。
樣品過(guò)濾的一個(gè)替代方法(或者是補(bǔ)充)是在進(jìn)樣之前離心。這是一個(gè)簡(jiǎn)單又相對(duì)便宜的方法。只要把樣品放進(jìn)離心管,Eppendorf 離心管或者一個(gè)96孔的離心板,再放到小型臺(tái)式離心機(jī)里,調(diào)整轉(zhuǎn)速到其最大速度,旋轉(zhuǎn)5-10min。
這會(huì)使會(huì)引起篩板堵塞的顆粒沉積到樣品瓶的底部,然后把樣品轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶或板中繼續(xù)進(jìn)行分析。這種技術(shù)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中對(duì)需要沉淀蛋白質(zhì)的樣品中已經(jīng)使用了很多年,而且極少出現(xiàn)顆粒物質(zhì)相關(guān)的問(wèn)題。
我曾經(jīng)見(jiàn)過(guò)這樣的例子,用0.2μm的濾膜過(guò)濾之后的樣品,UHPLC進(jìn)樣,這種樣品還是有一點(diǎn)渾濁并且引起了柱子堵塞,但是這個(gè)些微渾濁的樣品離心至澄清之后,柱子堵塞的情況就會(huì)減少很多。
使用在線過(guò)濾器
我非常認(rèn)同一個(gè)在線的過(guò)濾器是LC或者UHPLC中使用成本最低的附加裝置,可以提供最大的投資回報(bào)。這種過(guò)濾器是一個(gè)非常簡(jiǎn)單的改裝管配件,其中包含了一個(gè)特定孔徑的篩板,安裝在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子(保護(hù)柱,如果用到的話)之間。
現(xiàn)在最普遍的裝置是一個(gè)直徑接近37.5px,長(zhǎng)度62.5px不銹鋼配件,其中包含一個(gè)0.5或者0.2μm孔徑的可替換的篩板。另外一種裝置是包含相同孔徑大小篩板的PEEK手緊配件。這種PEEK過(guò)濾器整體是一次性的,但是因?yàn)樗炔讳P鋼過(guò)濾器中的一次性使用的篩板要貴,使用成本會(huì)比較昂貴。
這種在線過(guò)濾器孔徑會(huì)選擇比柱子篩板孔徑小一點(diǎn),因此它會(huì)在柱子堵塞之前先被堵塞。當(dāng)系統(tǒng)壓力開(kāi)始增加的時(shí)候,你就知道在線過(guò)濾器中篩板已經(jīng)開(kāi)始堵了,需要在完全堵住之前替換掉。
在線過(guò)濾器可以起到單獨(dú)的樣品過(guò)濾器一樣的功能,但在樣品前處理時(shí),不需要額外的人力工作。如果你樣品離心了,偶爾有一些顆粒沒(méi)有過(guò)濾掉,也會(huì)被下游的在線過(guò)濾器攔截住。
在線過(guò)濾器的另一優(yōu)點(diǎn)是它能夠很便捷的更換——如果你動(dòng)手能力強(qiáng),在5min內(nèi)你可以關(guān)掉泵、替換篩板、打開(kāi)系統(tǒng)并繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。
你可能想要重新進(jìn)一針系統(tǒng)適應(yīng)性樣品來(lái)檢查一下系統(tǒng)有沒(méi)有出問(wèn)題,使用在線過(guò)濾器不需要大量的調(diào)節(jié)和校準(zhǔn),而這些在更換保護(hù)柱時(shí)都需要重新做過(guò)。在線過(guò)濾器的最后一個(gè)好處是可以過(guò)濾掉泵密封件和進(jìn)樣閥因磨損產(chǎn)生的顆粒物。我強(qiáng)烈建議在每一個(gè)LC系統(tǒng)中都安裝一個(gè)在線過(guò)濾器,即使你已經(jīng)在使用保護(hù)柱了。
保護(hù)柱
保護(hù)柱(也叫做預(yù)柱)是一種很短的裝在分析柱上游的色譜柱。這種柱子長(zhǎng)度一般為10-20mm,包含與分析柱一樣的填料,使用不大于分析柱篩板孔徑的入口篩板和出口篩板。
保護(hù)柱有雙重功能,第一,入口篩板攔截可能堵塞分析柱的顆粒物,第二,填料與分析柱相同,它可以捕抓住那些可能會(huì)強(qiáng)烈或者不可逆附著在分析柱填料上的物質(zhì)?偹苤Wo(hù)柱會(huì)延長(zhǎng)分析柱的壽命,然而,保護(hù)柱有幾個(gè)潛在的問(wèn)題。
第一,他們比較貴——價(jià)格高出分析柱的40%甚至更多,考慮到增加的成本時(shí),你柱子的壽命是否有足夠的延長(zhǎng)?
第二,保護(hù)柱到底能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間?你得知道更換柱子的時(shí)間,在保護(hù)柱上的化學(xué)污染物積累太多之前,就要想辦法避免污染物進(jìn)入到分析柱中。因此,需要對(duì)進(jìn)樣次數(shù)計(jì)數(shù)或者做一個(gè)系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)來(lái)決定什么時(shí)候更換保護(hù)柱。
第三,你要判斷怎么來(lái)清洗保護(hù)柱。為了防止把污染物沖洗到分析柱中,保護(hù)柱和分析柱需要分開(kāi)來(lái)清洗嗎?
最后,你可能期望將一個(gè)20mm長(zhǎng)的保護(hù)柱加裝到150mm長(zhǎng)的分析柱上,使柱效提高10%,但是這種情況很少出現(xiàn)。原因是接入一根保護(hù)柱后,系統(tǒng)管路中會(huì)增加兩個(gè)柱頭連接件和一段管路,而且保護(hù)柱沒(méi)有分析柱裝柱那么容易安裝,以上兩個(gè)方面都會(huì)降低系統(tǒng)性能。結(jié)果就是如果你運(yùn)氣好的話,你會(huì)得到一樣的理論塔板數(shù),但常見(jiàn)的情況是柱效會(huì)稍有降低。
要不要用保護(hù)柱的選擇權(quán)在你。保護(hù)柱確實(shí)能延長(zhǎng)分析柱的壽命,但是我個(gè)人認(rèn)為在大多數(shù)情況下,這并不值得。
如果你選擇使用保護(hù)柱,我還是推薦在自動(dòng)進(jìn)樣器和保護(hù)柱之間連接使用一個(gè)在線過(guò)濾器。過(guò)濾器的錢(qián)只有保護(hù)柱的零頭,它還能延長(zhǎng)保護(hù)柱的使用壽命,就像它能延長(zhǎng)分析柱壽命一樣。
總結(jié)
盡管你不能讓你的分析柱壽命無(wú)限延長(zhǎng),但還是能用一些非常簡(jiǎn)單的方法來(lái)延長(zhǎng)色譜柱這個(gè)系統(tǒng)中比較昂貴部件的壽命。
首先,按照要求對(duì)樣品進(jìn)行前處理。樣品前處理的最后一步必須是過(guò)濾或者離心。其次,使用在線過(guò)濾器來(lái)保護(hù)保護(hù)柱和分析柱,免于被樣品中或者系統(tǒng)其它部分產(chǎn)生的顆粒物堵塞。再次,如果保護(hù)柱對(duì)你的應(yīng)用有意義的話,則使用保護(hù)柱來(lái)保護(hù)分析柱。最后,在每批樣品分析之后,使用強(qiáng)溶劑來(lái)沖洗柱子,除去在柱子上的任何強(qiáng)保留物質(zhì)。
此文章主要是針對(duì)柱子污染問(wèn)題,但色譜柱壽命也取決于檢測(cè)品種的方法耐用性,如果是難度很大的項(xiàng)目, 譬如化學(xué)藥品有多個(gè)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定,或中藥的指紋譜圖,往往方法耐用性 (robustness)較差,柱子壽命也會(huì)受到影響。挑選不同選擇性的色譜柱來(lái)改善分離度是提高方法耐用性的最佳選擇。