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HPLC法校正因子研究中的幾個(gè)問(wèn)題

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-12-09
核心提示:校正因子的研究對(duì)于選擇合適定量方式,準(zhǔn)確定量雜質(zhì)具有重要意義,因而成為雜質(zhì)分析方法研究中的重要內(nèi)容之一。那么,校正因子都有哪些特點(diǎn)?如何進(jìn)行測(cè)定呢?今天我們就來(lái)探討一下這個(gè)問(wèn)題。

校正因子的研究對(duì)于選擇合適定量方式,準(zhǔn)確定量雜質(zhì)具有重要意義,因而成為雜質(zhì)分析方法研究中的重要內(nèi)容之一。那么,校正因子都有哪些特點(diǎn)?如何進(jìn)行測(cè)定呢?今天我們就來(lái)探討一下這個(gè)問(wèn)題。


HPLC法具有將不同物質(zhì)分離后逐一定量的分離分析能力,在檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用,成為雜質(zhì)控制中常用而有效的手段之一。在雜質(zhì)對(duì)照品法、加校正因子的主成分自身對(duì)照法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法、峰面積歸一化法等幾種常用的雜質(zhì)定量方式中,校正因子的研究對(duì)于選擇合適定量方式,準(zhǔn)確定量雜質(zhì)具有重要意義,因而成為雜質(zhì)分析方法研究中的重要內(nèi)容之一。但從目前注冊(cè)申報(bào)資料實(shí)際情況來(lái)看,校正因子的研究和使用中尚存在一些需要進(jìn)一步思考和關(guān)注的問(wèn)題。

 

一般來(lái)講,HPLC定量測(cè)定中,物質(zhì)的檢測(cè)量W與色譜響應(yīng)值(峰面積等)A之間的比值稱為絕對(duì)校正因子,即單位響應(yīng)值(峰面積等)所對(duì)應(yīng)的被測(cè)物質(zhì)的量(濃度或質(zhì)量);而某物質(zhì)i與所選定的參照物質(zhì)s的絕對(duì)校正因子之比,即為相對(duì)校正因子,即通常所講的校正因子。

目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身對(duì)照法”定量相關(guān)特定雜質(zhì),這種定量方式因考慮了雜質(zhì)與主成分的絕對(duì)校正因子的不同所引起的測(cè)定誤差,將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的賦值信息轉(zhuǎn)化為常數(shù),固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,且不需長(zhǎng)期提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),因而成為現(xiàn)階段雜質(zhì)控制較為理想可行的手段。但這種方法有時(shí)會(huì)因不同儀器及色譜條件的波動(dòng),可產(chǎn)生一定范圍的誤差,需進(jìn)行充分的方法耐用性驗(yàn)證,并結(jié)合色譜峰定位控制等措施,將誤差控制在一定范圍內(nèi)。子的測(cè)定

 

在校正因子的研究和使用中,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、色譜條件、溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)等均是重要的影響因素,研究中需要予以關(guān)注。

首先,校正因子的測(cè)定需要用到特定雜質(zhì)及主成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)具備量值準(zhǔn)確的特點(diǎn),符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(對(duì)照品)的相關(guān)要求;

其次,確定校正因子的分析方法應(yīng)與最終確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法一致,色譜條件等需經(jīng)篩選優(yōu)化后確定,如有變更,需考慮對(duì)校正因子的影響,必要時(shí)重新確定;

最后,要關(guān)注影響待測(cè)物UV吸收的各種因素,如溶液制備所用溶劑最好與最終確定的流動(dòng)相相同,檢測(cè)波長(zhǎng)最好在特定雜質(zhì)及主成分UV曲線的峰或谷處,避開(kāi)吸收值急劇變化波段,以保證測(cè)定方法具有較好的耐用性,并保持測(cè)定結(jié)果的恒定。

一般情況下,校正因子可視具體情況通過(guò)如下幾種方法確定:
(1)單濃度點(diǎn)測(cè)定:制備適當(dāng)濃度的特定雜質(zhì)對(duì)照品溶液和主成分對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,照上式計(jì)算,得到校正因子。

(2)多濃度點(diǎn)測(cè)定:制備適當(dāng)?shù)母、中、低三水平濃度的特定雜質(zhì)對(duì)照品溶液和主成分對(duì)照品溶液(涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度),分別進(jìn)樣測(cè)定,照上式計(jì)算各校正因子,計(jì)算RSD,求平均值,得到校正因子。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定:精密稱取雜質(zhì)對(duì)照品和主成分對(duì)照品,分別制備系列溶液(涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度),分別進(jìn)樣后,按最小二乘法以進(jìn)樣量對(duì)響應(yīng)值(峰面積等)進(jìn)行線性回歸,求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線,兩曲線斜率之比即為校正因子。

(4)吸收系數(shù)比值法:對(duì)于UV檢測(cè)器來(lái)講,兩物質(zhì)的相對(duì)校正因子實(shí)際上也是兩物質(zhì)以流動(dòng)相為溶劑,在檢測(cè)波長(zhǎng)處的紫外吸收系數(shù)E1cm1%之比,故可按吸收系數(shù)法測(cè)定法的相關(guān)技術(shù)要求測(cè)定各自吸收系數(shù),如對(duì)照品級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、高中低三水平濃度測(cè)定、吸收度介于0.3~0.8之間、至少5臺(tái)不同型號(hào)的UV分光光度計(jì)、2份供試液同時(shí)平行制備測(cè)定、同臺(tái)儀器2份供試液的平行測(cè)定結(jié)果不超過(guò)±0.5%等。測(cè)定兩物質(zhì)的吸收系數(shù)后,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析確定兩物質(zhì)吸收系數(shù),計(jì)算比值,求得校正因子。

上述各方法中,(1)和(2)法較為簡(jiǎn)捷,可以快捷地量化特定雜質(zhì)與主成分紫外吸收特征的差異,多用于評(píng)估采用主成分自身對(duì)照法定量雜質(zhì)時(shí)是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法定量雜質(zhì),需將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值信息轉(zhuǎn)化為校正因子固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,那么校正因子的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵,校正因子的準(zhǔn)確計(jì)算應(yīng)符合更為嚴(yán)格的要求,需要考慮并控制求算校正因子過(guò)程中的各種誤差因素,以及儀器通用性和色譜系統(tǒng)的耐用性等因素,以便使求得的常數(shù)更為準(zhǔn)確并具代表性,此時(shí)采用(3)、(4)法更為適宜,如能考慮到測(cè)定人員、不同試驗(yàn)室因素的影響,會(huì)更加符合常數(shù)求算的基本要求。

 

根據(jù)雜質(zhì)研究相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則,為確保雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,一般情況下,校正因子在0.9~1.1時(shí)可不予校正,直接采用不加校正因子的自身對(duì)照法定量;

超出該范圍,如采用主成分自身對(duì)照法的定量方式,須用校正因子進(jìn)行校正,,即“加校正因子的主成分自身對(duì)照法”以保證雜質(zhì)定量的準(zhǔn)確性;

如校正因子在0.2~5.0范圍以外時(shí),表明雜質(zhì)與主成分的UV吸收相差過(guò)大,校正因子的作用會(huì)受到顯著影響,此時(shí)應(yīng)改變檢測(cè)波長(zhǎng)等檢測(cè)條件,使校正因子位于上述范圍內(nèi),或使用結(jié)構(gòu)或UV吸收與該雜質(zhì)接近的另一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參照物質(zhì)(如對(duì)照品易于獲得、標(biāo)準(zhǔn)已采用對(duì)照品外標(biāo)法定量的另一特定雜質(zhì)),重新確立校正因子;

如校正因子仍無(wú)法調(diào)節(jié)至適當(dāng)范圍,需考慮采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法等適當(dāng)?shù)碾s質(zhì)方式定量。

校正因子的應(yīng)用同吸收系數(shù)的使用類似,需要具備一定的前提條件,比如相同的檢測(cè)波長(zhǎng)、分析方法、色譜條件等。需要注意的是,雜質(zhì)的保留時(shí)間差別較大時(shí),峰形及峰面積會(huì)有較大差別,對(duì)校正因子的校準(zhǔn)作用也會(huì)產(chǎn)生明顯影響,因此色譜峰的保留時(shí)間要相對(duì)恒定,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要對(duì)相關(guān)特定雜質(zhì)的色譜峰規(guī)定相對(duì)保留時(shí)間的限定。

在目前的申報(bào)資料中,校正因子的研究和使用中存在一些需要關(guān)注的問(wèn)題。主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面:
   (1)特定雜質(zhì)直接采用主成分自身對(duì)照法定量,沒(méi)有進(jìn)行校正因子的研究以及測(cè)定結(jié)果校正前后的數(shù)據(jù)對(duì)比,無(wú)法判斷定量方式的合理性和測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

   (2)測(cè)定的校正因子超過(guò)指導(dǎo)原則中不需校正的范圍,仍直接采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。如某藥物中雜質(zhì)I、II、III校正因子分別為2.02、1.47、1.70,但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定包括上述三個(gè)雜質(zhì)的各種雜質(zhì)。

   (3)測(cè)得的校正因子不能有效校正測(cè)定結(jié)果,在沒(méi)有充分的數(shù)據(jù)支持的情況下,仍采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。如某青蒿素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中去氫青蒿素的定量使用相對(duì)于主成分的校正因子為0.019,該數(shù)值校正能否準(zhǔn)確定量雜質(zhì),沒(méi)有相應(yīng)研究工作的論證和對(duì)比檢測(cè)數(shù)據(jù)的支持顯然是不夠的。

綜上可見(jiàn),對(duì)于特定雜質(zhì)的控制,校正因子的研究和測(cè)定是非常必要的。評(píng)估雜質(zhì)定量是否需要采用校正因子校正,校正因子能否起到有效的校準(zhǔn)作用,首先要測(cè)定出校正因子,按照相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則的要求評(píng)估是否需要校正,并提供相應(yīng)的對(duì)比研究資料。這些研究數(shù)據(jù)應(yīng)包括雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對(duì)照法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)相同多批樣品雜質(zhì)定量測(cè)定結(jié)果的對(duì)比數(shù)據(jù),作為是否需要校正或能否有效校正檢測(cè)結(jié)果的支持與依據(jù)。

考慮到校正因子對(duì)雜質(zhì)定量的長(zhǎng)期影響,目前階段校正因子測(cè)定的技術(shù)要求、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求、測(cè)定方法和數(shù)據(jù)處理的要求等尚未十分明確、尚不統(tǒng)一普及,如校正因子需要載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),由省所進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定或進(jìn)行針對(duì)性技術(shù)復(fù)核具有一定必要性。

 

編輯:songjiajie2010

 
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