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RNA提取及注意事項(xiàng)(一)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-01-30  來源:網(wǎng)絡(luò)
核心提示:【目的】研究基因的表達(dá)和調(diào)控時,需要從組織或細(xì)胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫構(gòu)建和Northern Blot等分

【目的】
研究基因的表達(dá)和調(diào)控時,需要從組織或細(xì)胞中分離純化
RNA。RNA質(zhì)量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫構(gòu)建和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。
【主要試劑】
Trizol是一種新型總RNA抽提試劑,內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

1. Trizol試劑含有苯酚,具有毒性和刺激性,注重操作。

2. RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉,注重配帶手套,樣品盡可能蓋嚴(yán)。

3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率,因?yàn)橐徊糠諶NA會殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)(結(jié)締組織和骨除外)。在清洗和裂解細(xì)胞時最好在低溫下操作,防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特別結(jié)構(gòu),可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩,使細(xì)胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。
【預(yù)備工作】
RNA酶(Rnase)是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定,在一些極端的條件下只可暫時失活,但限制因素去除后又迅速恢復(fù)活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的Rnase完全失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上,因此制備RNA時必須戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部,可基本達(dá)到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

塑料制品:盡量使用一次性無菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品,如沒有開封使用過,通常不必再處理。

處理的步驟如下:

(1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%(DEPC-H2O)。(DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物,須在通風(fēng)櫥中小心使用)

(2)將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC-H2O,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

(3)將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中,將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口,高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

(4)滅菌塑料制品烘烤干燥,置潔凈處備用。

(5)玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時以上。

編輯:songjiajie2010

 
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