1.采樣目的

確保采集的樣品能代表全部被檢驗(yàn)的物質(zhì)，使檢驗(yàn)分析更具代表性。

2.采樣原則

采集的樣品要有代表性，采樣時(shí)應(yīng)首先對(duì)該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，檢查是否有污染源存在，同時(shí)能反映全部被檢食品的組成、質(zhì)量和衛(wèi)生狀況。

應(yīng)設(shè)法保持樣品原有微生物狀況，在進(jìn)行檢驗(yàn)前不得污染，不發(fā)生變化。

采樣必須遵循無(wú)菌操作程，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌，更不能含有此類消毒藥物，以避免殺掉樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。

3.采樣數(shù)量

取樣數(shù)量的確定，應(yīng)考慮分析項(xiàng)目的要求、分析方法的要求及被檢物的均勻程度三個(gè)因素。樣品應(yīng)一式兩份，分別供檢驗(yàn)、復(fù)檢使用，每份樣品數(shù)量一般不少于200g。

根據(jù)不同種類采樣數(shù)量略有不同，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)樣品一般為25克。

4.采樣方法

采取隨機(jī)抽樣的方式。

直接食用的小包裝食品，盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。

如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所采樣品冷卻至0－4℃。

不要使樣品過(guò)度潮濕，以防食品中固有的細(xì)菌增殖。

在將冷凍食品送到實(shí)驗(yàn)室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。

5.樣品的保存和運(yùn)送

樣品采集完后，應(yīng)迅速送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，送檢過(guò)程中一般不超過(guò)3h，如路程較遠(yuǎn)，可保存在1－5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在冷凍狀態(tài)下送檢。

冷凍樣品應(yīng)存放在－15℃以下冰箱內(nèi)；冷卻和易腐食品應(yīng)存放在0－5℃冰箱或冷卻庫(kù)內(nèi)；其它食品可放在常溫冷暗處。

運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。

待檢樣品存放時(shí)間一般不應(yīng)超過(guò)36小時(shí)。

（二）檢驗(yàn)樣品的制備

樣品的全部制備過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。

檢驗(yàn)冷凍樣品前應(yīng)先使其融化�？稍�0－4℃融化，時(shí)間不超過(guò)18小時(shí)，也可在溫度不超過(guò)45℃的環(huán)境中融化，時(shí)間不超過(guò)15分鐘。

檢驗(yàn)液體或半固體樣品前應(yīng)先將其充分搖勻。如容器已裝滿，可迅速翻轉(zhuǎn)25次；如未裝滿，可于7s內(nèi)以30cm的幅度搖動(dòng)25次。從混樣到檢驗(yàn)間隔時(shí)間不應(yīng)超過(guò)3分鐘。

開啟樣品包裝前，先將表面擦干凈，然后用75％乙醇消毒開啟部位及其周圍。

非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)，吸管插入樣品內(nèi)的深度不應(yīng)超過(guò)2.5cm，也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)。

粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基。

固體或半固體樣品可用滅菌的均質(zhì)杯稱取一定量，再加適量的稀釋液或培養(yǎng)基進(jìn)行均質(zhì)，從樣品的均質(zhì)到稀釋和接種，相隔時(shí)間不應(yīng)超過(guò)15分鐘，或是在無(wú)菌生理鹽水里放入玻璃珠，充分振蕩搖勻。

（三）檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室收到樣品后或是自己取樣后，首先進(jìn)行外觀檢驗(yàn)，及時(shí)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)過(guò)程中要認(rèn)真、負(fù)責(zé)，嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。

檢驗(yàn)所使用的稀釋液、試劑、培養(yǎng)基接觸的一切器皿必須經(jīng)過(guò)有效的滅菌。

實(shí)驗(yàn)室所用儀器、設(shè)備的性能應(yīng)定期檢查和校正。

制備試劑和培養(yǎng)基所用的水，應(yīng)為無(wú)離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。

檢驗(yàn)結(jié)束后，所有帶菌的培養(yǎng)基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過(guò)的器皿不應(yīng)殘留洗滌劑的痕跡。

（四）檢驗(yàn)記錄和結(jié)果的報(bào)告

經(jīng)檢驗(yàn)的每份樣品都應(yīng)有完整的檢驗(yàn)記錄。樣品檢驗(yàn)過(guò)程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗(yàn)記錄，以作為對(duì)結(jié)果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細(xì)、清楚、真實(shí)、客觀、不得涂改和偽造。

檢驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，及時(shí)填寫檢驗(yàn)報(bào)告書，簽字并經(jīng)負(fù)責(zé)人審核簽字后發(fā)出。

（五）樣品的微生物檢驗(yàn)流程

（六）微生物操作注意要點(diǎn)

無(wú)菌操作要求

（1）微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員，必須有嚴(yán)格的無(wú)菌觀念，許多實(shí)驗(yàn)要求在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，主要原因，一是防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個(gè)人污染；

（2）接種細(xì)菌時(shí)必須穿工作服、帶工作帽；

（3）進(jìn)行接種食品樣品時(shí)，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無(wú)菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用；

（4）接種食品樣品時(shí)，應(yīng)在進(jìn)無(wú)菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/span>

（5）進(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用；

（6）從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊；

（7）接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌活樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過(guò)火焰消毒；

（8）接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時(shí)還要燒到針和環(huán)與桿的連接處；

（9）吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的吸爾球吸取，不得直接用口吸。 

無(wú)菌間使用要求

（1）無(wú)菌間應(yīng)密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無(wú)菌間大小相應(yīng)的緩沖間及門，另盡量設(shè)有小窗，以備進(jìn)入無(wú)菌間后傳遞物品；

（2）無(wú)菌間應(yīng)保持清潔，工作后用巴氏消毒溶液消毒，擦拭工作臺(tái)面，不得存放與試驗(yàn)無(wú)關(guān)的物品；

（3）無(wú)菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈消毒（30W，1m）時(shí)，照射時(shí)間不少于30分鐘，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

（4）處理和接種食品樣品時(shí)，進(jìn)入無(wú)菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過(guò)小窗傳遞。

消毒滅菌要求

微生物檢測(cè)用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。

（1）滅菌前準(zhǔn)備

①所有需經(jīng)滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面氣孔打開。

裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞，試管蓋好蓋，用紙包好。

（2）裝放

將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過(guò)擠。

（3）設(shè)備檢查

①檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無(wú)損壞，是否平整。

②壓力表蒸氣排盡時(shí)是否停留在零位，蓋好蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無(wú)堵塞。

③對(duì)有自動(dòng)電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。

（4）滅菌處理

手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進(jìn)行：

①高壓鍋內(nèi)加入清水（重復(fù)使用時(shí)應(yīng)將水量補(bǔ)足，水變混濁需要更換）。

②將要滅菌的物品放入滅菌鍋內(nèi)，蓋好蓋子。

接通電源，加熱，水沸騰后打開放氣閥排氣，直到壓力表指針降到0.05Mpa時(shí)，關(guān)掉放氣閥。

指針指到121℃時(shí)開始計(jì)時(shí)，達(dá)到要求的滅菌時(shí)間關(guān)掉開關(guān)，冷卻直到壓力降到0.05Mpa即可通過(guò)放氣閥緩慢放氣。

（5）滅菌溫度與時(shí)間

①不同類型培養(yǎng)基的滅菌溫度與時(shí)間的關(guān)系見下表：

②滅菌處理：滅菌后物品，按正常情況已屬無(wú)菌，從滅菌器中取出應(yīng)仔細(xì)檢查，以免再度污染。

物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無(wú)菌物品使用。

取出的物品，如外包裝有明顯的水浸者，不可作為無(wú)菌物品使用。

培養(yǎng)基或試劑等，應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài)，未達(dá)到者應(yīng)廢棄。

取出的物品掉落在地或誤放不潔之處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無(wú)菌物品使用。

取出的合格滅菌物品，應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。

凡屬合格物品，應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。

每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時(shí)間、操作者。

（6）有毒有菌污物處理要求

微生物實(shí)驗(yàn)室所用實(shí)驗(yàn)器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律不得帶出實(shí)驗(yàn)室。

經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點(diǎn)，待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌。

經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小時(shí)，再經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗滌。

打碎的培養(yǎng)物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時(shí)后再擦拭干凈。 

（7）玻璃器皿的清洗要求

①目的  

為了保證微生物實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，必須把器皿徹底清洗干凈。

②注意事項(xiàng)

任何洗滌方法，都不應(yīng)對(duì)玻璃器皿有所損傷，不能用有腐蝕作用的化學(xué)藥劑，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來(lái)擦拭玻璃器皿。

一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時(shí)，后用水沖洗干凈。

用過(guò)的器皿應(yīng)立即洗滌，放置太久會(huì)增加洗滌困難。

強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及其它氧化物和有揮發(fā)性的有毒物品，都不能倒在洗滌槽內(nèi)，以免污染環(huán)境水質(zhì)，必須倒在廢水缸中。

含有對(duì)人體有傳染性病菌的器具，應(yīng)先煮沸滅菌后再進(jìn)行洗滌。

難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起，以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無(wú)油的器皿混在一起，否則使本來(lái)無(wú)油的器皿沾上了油垢，浪費(fèi)藥劑和時(shí)間。

洗滌劑的種類：水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂。

③洗滌方法

含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿的洗滌方法：事先應(yīng)將器皿中的瓊脂刮去，然后用清水洗滌，并用試管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自來(lái)水（蒸餾水）沖洗。洗好后的器皿應(yīng)倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無(wú)水滴。

載玻片及蓋玻片的洗滌法：新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時(shí)，然后用自來(lái)水沖洗2~3次，最后用蒸餾水換洗2~3次。用過(guò)的載玻片及蓋玻片，應(yīng)用紙擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來(lái)水沖洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小時(shí)，再用蒸餾水沖洗至中性。

移液管、倒管的洗滌方法：新的移液管及倒管先在的５％鹽酸溶液中浸一小時(shí)，然后用自來(lái)水沖洗幾次，最后用蒸餾水換洗幾次。用過(guò)的移液管、倒管先用自來(lái)水洗去表面的殘液，再放在洗衣粉水中浸泡一小時(shí)以上，再用自來(lái)水沖洗至管內(nèi)壁無(wú)殘?jiān)�，最后用蒸餾水換洗次，晾干后入恒溫干燥箱中烘干。

（8）培養(yǎng)基、無(wú)菌水的制備

①基本原理

培養(yǎng)基的種類很多，不同微生物所需要的培養(yǎng)基不同。培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為液體、固體、半固體三種類型，我們實(shí)驗(yàn)室常用的是固體培養(yǎng)基。

②器材

三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、藥勺、杜氏小管、硅膠塞（棉塞）、電爐。

培養(yǎng)基的種類

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基等。

方法步驟

培養(yǎng)基的制備：

稱量：根據(jù)培養(yǎng)基的配方，稱取適量藥品于搪瓷杯中。

溶解：用量筒量取所需水量，置電爐上加熱，一邊攪拌，至完全溶解，加熱至沸騰，拔掉電源，待冷卻。

分裝：根據(jù)不同需要，立即趁熱分裝入三角瓶或試管中，分裝三角瓶以不超過(guò)三角瓶一半為宜，分裝試管一般為管長(zhǎng)的1/5（需根據(jù)試管的大小而定）。液體培養(yǎng)基如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基約分裝10毫升左右。

塞橡膠（棉）塞：裝好培養(yǎng)基的試管應(yīng)塞上橡膠（棉）塞，松緊合適，緊貼管壁，不留縫隙，約1/2塞入內(nèi)，這樣即可過(guò)濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。

包裝：三角瓶棉塞頭部應(yīng)用錫箔紙包扎，試管集中于試管簍。

無(wú)菌水的制備：

用10mL移液管量取9.0mL蒸餾水（稀釋水）裝入試管中。

用250mL量筒量取225mL蒸餾水（稀釋水）裝入250mL的三角瓶中，可置少許玻璃珠于三角瓶?jī)?nèi)，塞上橡膠（棉）塞用牛皮紙包扎好，高壓滅菌備用。 

（9）設(shè)備使用原則

①實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用由實(shí)驗(yàn)員嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行，其他人員不得隨意操作。

②實(shí)驗(yàn)設(shè)備的日常維護(hù)保養(yǎng)由實(shí)驗(yàn)員根據(jù)設(shè)備操作說(shuō)明書進(jìn)行，出現(xiàn)不可排除的故障時(shí)，經(jīng)部門總經(jīng)理批準(zhǔn)，商請(qǐng)專業(yè)人員維修。

③實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行計(jì)量檢測(cè)，確保儀器的準(zhǔn)確性。

④實(shí)驗(yàn)員應(yīng)愛護(hù)儀器設(shè)備，使用前應(yīng)檢查，使用后應(yīng)及時(shí)清理清潔，并定期維護(hù)保養(yǎng)，下班前應(yīng)檢查設(shè)備電源是否關(guān)閉。

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