（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>學(xué)習(xí)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法。

（二）實(shí)驗(yàn)原理：用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。

簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡(jiǎn)單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G⁺）和革蘭氏陰性菌（G^—）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。

該染色法所以能將細(xì)菌分為G⁺菌和G^—菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G^—菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G⁺菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。

（三）實(shí)驗(yàn)器材

1、活材料：培養(yǎng)12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌（Escherichia coli）

2、染色液和試劑：結(jié)晶紫（附二、（一）、3）、盧哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃紅（附二、（一）、5）、復(fù)紅（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油

3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

（四）實(shí)驗(yàn)方法：

1、簡(jiǎn)單染色：

（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。

（2）晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。

（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）

（4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染色1-2min。

（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液

（6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。

（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂�，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。

2、革蘭氏染色：

（1）涂片：涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片相同。

（2）晾干：與簡(jiǎn)單染色法相同。

（3）固定，與簡(jiǎn)單染色法相同

（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。

（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。

（6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。

（7）水洗：用水洗去碘液。

（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。

（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。

（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。

（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

（12）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。

（13）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：

①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。

②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。

（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)

給出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。

（六）注意事項(xiàng)

1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。

2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

3.選用幼齡的細(xì)菌。G⁺菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。