1、 了解測(cè)定蛋白質(zhì)的常用方法

2、 掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定的經(jīng)典Lowry – Folin法。

二、 實(shí)驗(yàn)原理

在堿性溶液中，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅鹽可產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，產(chǎn)生絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原，產(chǎn)生深藍(lán)色復(fù)合物。在一定的條件下，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比。在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定樣品的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，可確定其蛋白質(zhì)含量。這種方法是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。

三、 實(shí)驗(yàn)步驟

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1) 取10ml具塞試管6支，編號(hào)，分別準(zhǔn)確吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相應(yīng)的試管中，在各試管中分別加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00ml的蒸餾水，使總體積達(dá)到1.00ml。不同濃度BSA 溶液的配置

編號(hào) 0（空白） 1 2 3 4 5

BSA （ml） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

水（ml） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0

BSA 質(zhì)量（µg） 0 40 80 120 160 200

(2) 取試劑A15.00ml，試劑B0.75ml和試劑C0.75ml，在50ml三角瓶中混勻，在每只試管中分別準(zhǔn)確加入此試劑1.00ml，充分搖勻，靜置15min.

(3) 分別在各試管中準(zhǔn)確加入Folin-酚試劑稀釋液3.00ml，立刻震蕩，充分搖勻。

(4) 靜置30min，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定每個(gè)試管中溶液的吸光度(A值)。

(5) 以A值為縱坐標(biāo)，BSA 質(zhì)量(即0~200µg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2。

2、 樣品的測(cè)定

將啤酒樣品適當(dāng)稀釋(20倍)，吸取2份，各1.00ml，重復(fù)步驟1中的(2)~(4)。

四、 實(shí)驗(yàn)試劑

1、 試劑A：稱取Na2CO3100.0g溶于1000ml(最終體積)0.5mol/LNaOH中。

2、 試劑B：稱取CuSO4·5H2O1.0g溶于100ml(最終體積)蒸餾水中。

3、 試劑C：稱取酒石酸鉀鈉2.0g溶于100ml(最終體積)蒸餾水中。

4、 牛血清蛋白 (BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白，配制成濃度為200µg/ml的溶液。

5、 2mol/LFolin-酚試劑。

五、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與處理

分組 0（空白） 1 2 3 4 5 樣品1 樣品2

吸光度 0.000 0.073 0.157 0.216 0.273 0.341 0.172 0.164

樣品中蛋白質(zhì)的含量(µg/ml) = XA Ⅹ N Ⅹ 0.001

式中，XA——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的蛋白質(zhì)量(對(duì)應(yīng)稀釋樣品中的蛋白質(zhì)濃度，µg/ml) N——樣品的稀釋度數(shù)(N=20)

計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 0.0017x + 0.0078(R2=0.9957)

當(dāng)y1=0.172時(shí)，代入得x1=96.59(µg/ml)樣品1中蛋白質(zhì)含量m1=1.93mg/ml

當(dāng)y1=0.172時(shí)，代入得x1=96.59(µg/ml)樣品1中蛋白質(zhì)含量m1=1.93mg/ml

當(dāng)y2=0.164時(shí)，代入得x2=91.88(µg/ml)樣品2中蛋白質(zhì)含量m2=1.84mg/ml

平均含量：(1.93+1.84)/2=1.885 mg/ml

平均偏差：(1.93-1.84)/2 = 0.045

相對(duì)平均偏差：0.045/1.885 Ⅹ 100% = 2.39%

六、 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、 加入Folin-酚試劑后立即將反應(yīng)液搖勻，以便Folin-酚試劑在堿性溶液中破壞之前即能被銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物還原。

2、 短時(shí)間內(nèi)反應(yīng)液的顏色保持穩(wěn)定，因此，靜置30min后應(yīng)立即測(cè)定吸光度，若拖延時(shí)間過長(zhǎng)，顏色將會(huì)變化，影響測(cè)定結(jié)果。

七、 思考題

1、 測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的常用方法有哪些?其原理、適用性如何?

答：①凱氏定氮法

原理：樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氮(消化)，氮又與硫酸作用，變成硫酸氫。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氫氣，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品的氮含量，再乘以6.25，即得樣品中蛋白質(zhì)含量，以甘氨酸為例，反應(yīng)式為：

NH2CH2COOH + 3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3

2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4

(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+NaSO4+2NH3

適用性：用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定，干擾少，費(fèi)事太長(zhǎng);靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為±2%。

②雙縮脲法

原理：在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或連個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)量蛋白質(zhì)含量。

適用性：用于快速測(cè)定，但不太靈敏;不同蛋白質(zhì)顯色相似;誤差范圍為1~10µg蛋白質(zhì)

③Folin-酚試劑法

原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅鹽可產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，產(chǎn)生絡(luò)合物。此絡(luò)合物會(huì)將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原，產(chǎn)生深藍(lán)色復(fù)合物。在一定的條件下，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比。在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定樣品的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，可確定其蛋白質(zhì)含量。

適用性：耗時(shí)長(zhǎng)，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí);顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化，靈敏度高;最低位0~5µg;通常測(cè)定范圍是20~250µg;也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

④紫外吸收法

原理：蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有紫外吸收的性質(zhì)，吸收峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在280nm時(shí)的吸光度值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

適用性：用于層析注流出液的檢測(cè);較為靈敏50~100µg;適用于與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。

⑤考馬斯亮藍(lán)法

原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使燃料的最大吸收峰位置λmax，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm下測(cè)定的吸光度值，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

適用性：干擾物質(zhì)少，顏色穩(wěn)定，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化;靈敏度最高為1~5µg。

2、 使用分光光度計(jì)時(shí)應(yīng)注意哪些問題?

答：分光光度計(jì)特點(diǎn)：準(zhǔn)確度高，測(cè)量范圍廣，在一定條件下可同時(shí)測(cè)定水樣中兩種或兩種以上的物質(zhì)組成含量。

注意：①使用前，仔細(xì)閱讀其使用說明書;②若大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新調(diào)零及滿度后，再測(cè)量;③指針式儀器在未接通電源時(shí)，電表的指針必須位于零刻度，若不是，則需進(jìn)行機(jī)械調(diào)零;④操作人員不宜輕易觸動(dòng)燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率;⑤放大其靈敏度換擋后，必須重新調(diào)零;⑥比色皿使用時(shí)需注意方向性，并應(yīng)配套使用，以延長(zhǎng)其使用壽命，使用完畢后，應(yīng)立即用蒸餾水沖洗干凈，并用干凈柔軟的紗布擦水跡，以防表面光潔度被破壞。