1、載玻片的處理:
抗原修復(fù)過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行,可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑,對已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下:
1.1 APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留20~30秒鐘,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES,置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結(jié)果。
1.2 HistogripTM:將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中,停留1~2分鐘,然后用雙蒸水快速清洗三次,室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時,裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鐘,60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化:
2.1 胰蛋白酶:一般使用濃度為0.05%~0.1%,消化時間為37℃、10~40分鐘,主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶:一般使用濃度為0.4%,消化時間為37℃、30~180分鐘,主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示,如:Laminin(層粘蛋白),Collagen IV(IV型膠原)等。
2.3 皂素(Saponin):一般使用濃度為2~10g/ml的saponin溶液,消化時間為室溫孵育30分鐘。
3、抗原熱修復(fù):
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件,選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。抗原熱修復(fù)可選用各種緩沖液,如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等,但實(shí)驗(yàn)證明,以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制,取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中,混勻,其pH值在6.0 0.1,如因蒸餾水本身造成的pH值偏差,請自行調(diào)整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,3%H2O2處理10分鐘,蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘(注意:無論是使用醫(yī)用或家用微波爐,請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件,務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器,室溫冷卻10~20分鐘(注意:不可將切片從緩沖液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型)。PBS洗,下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內(nèi),使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后),計(jì)時1~2分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS洗2分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時15~20分鐘,然后端離電爐,室溫冷卻20~30分鐘,蒸餾水沖洗,PBS洗,下接免疫組化染色步驟。
4、免疫組化染色步驟:
(以美國ZYMED公司SP試劑盒為例)
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,(如需采用抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行)。
5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS沖洗,5分鐘×3次。
滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃或室溫孵育10~30分鐘。
PBS沖洗,5分鐘×3次。
滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育10~30分鐘。
PBS沖洗,5分鐘×3次。
顯色劑顯色(DAB或AEC)。
自來水充分沖洗,復(fù)染,封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片4~8m,室溫放置30分鐘后,入4℃丙酮固定10分鐘,PBS洗,5分鐘×3。用3%過氧化氫孵育5~10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗,5分鐘×2。
下接免疫組化染色操作步驟。
抗原修復(fù)過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行,可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑,對已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下:
1.1 APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留20~30秒鐘,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES,置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結(jié)果。
1.2 HistogripTM:將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中,停留1~2分鐘,然后用雙蒸水快速清洗三次,室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時,裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鐘,60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化:
2.1 胰蛋白酶:一般使用濃度為0.05%~0.1%,消化時間為37℃、10~40分鐘,主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶:一般使用濃度為0.4%,消化時間為37℃、30~180分鐘,主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示,如:Laminin(層粘蛋白),Collagen IV(IV型膠原)等。
2.3 皂素(Saponin):一般使用濃度為2~10g/ml的saponin溶液,消化時間為室溫孵育30分鐘。
3、抗原熱修復(fù):
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件,選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。抗原熱修復(fù)可選用各種緩沖液,如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等,但實(shí)驗(yàn)證明,以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制,取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中,混勻,其pH值在6.0 0.1,如因蒸餾水本身造成的pH值偏差,請自行調(diào)整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,3%H2O2處理10分鐘,蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘(注意:無論是使用醫(yī)用或家用微波爐,請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件,務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器,室溫冷卻10~20分鐘(注意:不可將切片從緩沖液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型)。PBS洗,下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內(nèi),使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后),計(jì)時1~2分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS洗2分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時15~20分鐘,然后端離電爐,室溫冷卻20~30分鐘,蒸餾水沖洗,PBS洗,下接免疫組化染色步驟。
4、免疫組化染色步驟:
(以美國ZYMED公司SP試劑盒為例)
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,(如需采用抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行)。
5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS沖洗,5分鐘×3次。
滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃或室溫孵育10~30分鐘。
PBS沖洗,5分鐘×3次。
滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育10~30分鐘。
PBS沖洗,5分鐘×3次。
顯色劑顯色(DAB或AEC)。
自來水充分沖洗,復(fù)染,封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片4~8m,室溫放置30分鐘后,入4℃丙酮固定10分鐘,PBS洗,5分鐘×3。用3%過氧化氫孵育5~10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗,5分鐘×2。
下接免疫組化染色操作步驟。