VIP標(biāo)識 上網(wǎng)做生意,首選VIP會員| 設(shè)為首頁| 加入桌面| | 手機版| RSS訂閱
食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號
 
當(dāng)前位置: 首頁 » 食品專題 » 生物實驗技術(shù) » 免疫性技術(shù) » 正文

免疫電泳(Immunoelectrophoresis)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

原理

蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì),它同時具有游離氨基和羧基。每種蛋白質(zhì)都有它自己的等電點。等電點的高低取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì),在等電點時,蛋白質(zhì)所帶的正負(fù)電荷相等。在pH大于等電點溶液中,羧基解離多,此時蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在電場中向正極移動。反之,在pH小于等電點的溶液中,氨基解離多,此時蛋白質(zhì)帶正電荷,在電場中向負(fù)極移動。

這種帶電質(zhì)點在電場中向著帶異相電荷的電場移動,稱為電泳。帶電質(zhì)點所以能在電場中移動以及具有一定的移動速度,取決于其本身所帶的電荷、電場強度、溶液的pH值、粘度以及電滲等因素。

影響電泳的因素

不同帶電質(zhì)點在同一電場中的遷移率(或泳動度)不同,影響遷移率的因素有:①帶電質(zhì)點的性質(zhì):即顆粒所帶凈電荷的量,顆粒大小及形狀等。帶電荷越多,分子越小,泳動速度越快;②電場強度:電場強度是單位厘米的電位差。電場強度越大,帶電質(zhì)點泳動速度越快。反之亦然;③溶液中pH值:溶液的pH值決定了帶電質(zhì)點的解離程度,也決定了物質(zhì)所帶電荷的多少。對蛋白質(zhì)、氨基酸等兩性電解質(zhì)而言,pH值離等電點越遠(yuǎn),顆粒所帶的電荷越多,電泳速度也越快。反之則越慢。蛋白質(zhì)在酸性溶液中易變性,在偏堿溶液中比較穩(wěn)定,所以蛋白質(zhì)電泳大多用pH8.28.8的巴比妥或硼酸緩沖液,在這種pH中,血清蛋白一般都帶負(fù)電荷;④溶液的離子強度:溶液的離子強度越高,顆粒泳動速度越慢,反之越快。血清電泳一般最適宜離子強度在0.0250.075之間。離子強度越低,緩沖液的電流下降,擴散現(xiàn)象嚴(yán)重,使分辨力明顯降低。離子強度太高,將有大量的電流通過瓊脂板,由此而產(chǎn)生的熱量使板中水分大量蒸發(fā),嚴(yán)重時可使瓊脂板斷裂而導(dǎo)致電泳中斷。溶液中離子強度與溶液的濃度成正比。μ=1/2CZ2(μ為離子強度,C為克分子濃度,Z為離子的價數(shù));⑤電滲作用:電滲是在電場中液體對于固體支持物的相對移動。由于瓊脂中含有SO42-,帶負(fù)電荷,造成靜電感應(yīng)致使附近的水帶正電荷,而向負(fù)極移動,所以電泳時有兩種力,即電泳力和電滲力。如果物質(zhì)原來帶正電荷,向負(fù)極移動,則因電滲作用向負(fù)極移動得更快。如果物質(zhì)向正極移動,所帶電荷少,電泳力抵不過電滲力,則也向負(fù)極移動,血清中的γ球蛋白就是如此;⑥吸附作用:即介質(zhì)對樣品的滯留作用。它導(dǎo)致了樣品的拖尾現(xiàn)象而降低了分辨率。紙的吸附作用最大,醋酸纖維膜的吸附作用較小或無;⑦電泳時間:電泳時間與遷移率成正比。

電泳中常用儀器

1.電泳儀

2.電泳槽 一般采用閉合式,即為了防止在電泳過程中產(chǎn)熱,而使瓊脂凝膠水分過度蒸發(fā)的設(shè)施。作電極用的鉑金絲必須與電泳槽等長,這樣電場才能均勻。電泳槽容量不宜過小,以防止溶液的濃度、pH值或離子強度發(fā)生改變,影響電泳條件的恒定性。

瓊脂的選擇和制備

電泳是利用一種支撐物作為一種介質(zhì)讓帶電粒子通過,而其本身不發(fā)生變化。支撐物一般是采用瓊脂或瓊脂糖、纖維素膜、濾紙以及聚丙烯酰胺凝膠等。

1.支撐物的條件

⑴惰性物質(zhì),電泳后本身不發(fā)生變化。

⑵制成凝膠后,其分子排列均勻,孔徑大小一致便于帶電質(zhì)體自由通過。

⑶透明、無雜質(zhì)、電滲作用小,并且有一定的粘度與脆性。

⑷價格便宜。

一般多用瓊脂粉或瓊脂糖。瓊脂糖是瓊脂粉進(jìn)一步提煉而成,很少或幾乎無電滲作用。

2.凝膠板的制備 稱取所需要量的瓊脂粉,加入緩沖液(瓊脂濃度一般1%2%,瓊脂糖0.75%1.5%),同時加萬分之一的硫柳汞防腐。水浴煮沸,待瓊脂完全溶化后,液體清涼,再煮一段時間。選擇適當(dāng)大小的、無油膩、無劃痕的干凈玻璃板,根據(jù)所需的厚度(一般為2mm4mm厚),計算好瓊脂的用量。把玻片置于事先用水準(zhǔn)儀測試的平臺上,倒入熔化的瓊脂,注意不要產(chǎn)生氣泡。冷卻后,按事先制好的圖形大孔,用點水筆尖挑去孔內(nèi)的瓊脂,在火焰下輕烤以封底,以防止樣品從瓊脂底部泳過。然后加樣,不用的瓊脂板,放入冰箱中,注意防止干涸和冰凍。

緩沖液的選擇與配制

常用的電泳緩沖液有以下兩種。

1. pH8.6離子強度0.025Mol/L0.075Mol/L的巴比妥緩沖液,配制方法如表:

巴比妥緩沖液配制

離子強度 巴比妥鈉(g) 巴比妥(g 加水至(ml

0.075

15.45

2.76

1 000

0.050

10.30

1.84

1 000

0.025

10.30

1.84

2 000

2pH8.6硼酸緩沖液,離子強度0.05Mol/L

硼酸 6.70g

硼砂(Na2B4O7·10H2O 13.40g

H2O 加至 1 000ml

緩沖液配制后,加萬分之一的硫柳汞防腐。兩側(cè)電泳槽加緩沖液至2345的槽體積,注意兩側(cè)一樣多,以免造成液面差,產(chǎn)生虹吸作用,影響電泳。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)泳動至槽內(nèi)后,就應(yīng)該更換緩沖液。有人認(rèn)為長久電泳過的電泳液易于把血清中各成分分開,而新配制的則差一些。為了防止緩沖液離子強度的改變,可以在每次電泳時更換正負(fù)極(這是目前廣泛采用的);也可以在下一次電泳前,將兩槽內(nèi)的緩沖液混合后再用。但也有人認(rèn)為不能混合再用,必須更新。

電場強度的顯示

Vcm長或Icm寬表示。電壓的測量必須用電壓表測量凝膠板兩端的電壓差,再除以板長,而不能以電泳儀上的電壓數(shù)表示,當(dāng)然這兩者有一定的相關(guān)性。電泳儀上的電流強度除以凝膠板寬即可代表電場強度。在實際工作中,很難有兩項指標(biāo)都符合的調(diào)控,因此只能根據(jù)取其一個指標(biāo)進(jìn)行調(diào)控,一般多按電流計算。

結(jié)果觀察與標(biāo)本的保存

對于與免疫有關(guān)的電泳,一般能形成明顯的抗原抗體復(fù)合物,因此可以直接觀察。也可以染色觀察。染色后同時也起到了保存標(biāo)本的作用。具體步驟如下:

1.將瓊脂板放入生理鹽水中4浸泡2天~3天,每天換液數(shù)次,以洗去多余的蛋白質(zhì)。

2.染色 將洗好的瓊脂板放入氨基黑或偶氮胭脂紅染色液中染色15min30min。

0.5%氨基黑染色液的配制:

氨基黑4B10B也可) 0.50g

甲醇 5ml

冰醋酸 10ml

H2O 40ml

0.75%偶氮胭脂紅染色液的配制:

偶氮胭脂紅 1.50g

甲醇 100ml

冰醋酸 20ml

H2O 80ml

先將染料放入研缽中,邊研磨邊加甲醇,使染料充分溶解,再加冰醋酸,最后加蒸餾水,以濾紙過濾,置棕色瓶保存。

3.脫色 染色后,將瓊脂板放入脫色液中脫色,至瓊脂板底色脫凈為止,脫色液要勤換。

脫色液的配制:

乙醇 45ml

冰醋酸 5ml

H2O 50ml

脫色液用過后,可用活性炭吸附染色顆粒,過濾后,可再使用。

4.漂洗 用蒸餾水漂洗。

5.制膜 把瓊脂膠滑到玻璃紙上,下墊一玻璃塊,展平玻璃紙。在瓊脂表面上抹一層甘油(以防干裂),放37溫箱烘干即可。也可以先制膜后染色。

對于非免疫性電泳標(biāo)本的染色基本同于免疫電泳。但不要進(jìn)行漂洗,電泳后直接投入染色液中或固定后投入染色液中。

6.標(biāo)本的保存 主要是染色后拍照保存,也可制膜保存。

電泳的分類

1.根據(jù)支撐物的不同可分為:

凝膠電泳:如瓊脂電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。

紙或纖維素膜電泳:如濾紙電泳、醋酸纖維膜電泳、硝酸纖維素膜電泳等。

粉末電泳:如淀粉、纖維素粉電泳等。

2.根據(jù)電場強度的不同可分為:

低壓電泳:電場強度1V/cm5V/cm,電泳時間較長,可數(shù)小時至十幾小時。

中壓電泳:電場強度5V/cm20V/cm,電泳時間一般數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘。

⑶高壓電泳:電場強度20V/cm200V/cm,電泳時間短,一般為數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘。

3.根據(jù)離子強度的不同而分為:

⑴連續(xù)電泳:是指電泳槽緩沖液的類型與離子強度和玻璃板上支撐物的一致。

⑵非連續(xù)電泳:使電泳槽內(nèi)緩沖液的類型與離子強度和玻璃板上支撐物的不一致。一般常采用瓊脂板的離子強度為電泳槽的一半。

4.根據(jù)電泳的目的可分為:區(qū)帶電泳、免疫電泳 胞電泳等

5.根據(jù)形狀可分為火箭電泳、圓盤電泳等。

 

 
[ 網(wǎng)刊訂閱 ]  [ 食品專題搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關(guān)閉窗口 ] [ 返回頂部 ]

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點擊排行
 
 
Processed in 0.387 second(s), 19 queries, Memory 0.97 M