IgG的分離與提純

（一）材料與試劑配制
1．動物血清
2．硫酸銨飽和溶液
硫酸銨 800g~850g
H2O 1 000ml
加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28％NH4OH調(diào)pH至7.0（不調(diào)pH值也可以）。
注：硫酸銨以質(zhì)量優(yōu)者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過夜后濾過，加熱蒸發(fā)H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．1％BaCl2溶液
5．納氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后過濾，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃紙）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。
2．3 000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。
3．在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30ml，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30min。
4．3 000r/min離心20min，棄上清。
5．于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。
6． 3 000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2~3次。
7． 用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。
8． 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次。
以1％BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 （取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現(xiàn)磚紅色即認為有NH4 存在），直至無 SO42-或NH4 出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
9． 離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．過DEAE－纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術(shù)）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白質(zhì)及其定量鑒定（見本章第八節(jié)）。
12．IgG的純度鑒定 可采用下列方法之一鑒定。
⑴ 區(qū)帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現(xiàn)一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。
⑵ 瓊脂雙相雙擴散鑒定：預(yù)先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現(xiàn)一條沉淀線。
⑶ 免疫電泳鑒定：（操作見第三章免疫電泳部分）�？變�(nèi)加待測樣品，電泳后，在槽內(nèi)加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結(jié)果。如果提取的IgG純的話，則只出現(xiàn)一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區(qū)。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
⑷ 圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現(xiàn)數(shù)十條區(qū)帶，而純化的IgG則只有一條區(qū)帶。
13．IgG的濃縮與保存
⑴ IgG的濃縮：參看本章第九節(jié)。
⑵ IgG的保存：一般濃縮至1％以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復(fù)凍融。
（三）IgG的簡易快速提取法
應(yīng)用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG，不僅操作復(fù)雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取IgG時，則往往采取下列的簡易辦法。
1． DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。
⑴ 以一定數(shù)量的DEAE52放入燒杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復(fù)一次。
⑵用布氏漏斗（內(nèi)放兩層濾紙）過濾。
⑶以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。
⑷于4℃中放置1h，中間攪拌數(shù)次。
⑸用布氏漏斗抽濾，再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。
2．DEAE－SephadexA－50為弱堿性陰離子交換劑，經(jīng)NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ－G。這種提取法流程大大縮短，純化前后樣品體積變化不大，而且所得γ－G無變性現(xiàn)象。經(jīng)過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE－SephadexA－50若干克，懸浮于蒸餾水中，1h后傾去上層小顆粒，然后用0.50Mol/L NaOH處理1h，蒸餾水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液體體積1/4的濾干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不時攪拌、抽濾、收集濾液。
⑶ 再用同樣重量的DEAE－SephadexA－50處理濾液。反復(fù)處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為γ－G制品。
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。
（四）禽血清IgG的分離與提純（Na2SO4法）
1．試劑
⑴ 5％葡聚糖硫酸鹽
⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
⑶ 無水硫酸鈉
⑷ pH8.2硼酸鹽緩沖液
⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
2．操作方法
⑴ 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸鹽液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，靜置，然后離心去沉淀，此步目的是為了去掉脂類物質(zhì)。
⑵ 于上清液中加無水硫酸鈉使每毫升血清含0.18g，緩慢加入，混勻，靜置30min，3 000r/min離心去上清。
⑶ 以pH8.2硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成0.16g／ml，同上法離心去上清。
⑷ 重復(fù)步驟⑶，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
⑸ 以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后裝透析袋除鹽48h。
⑹ 過SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。
⑺ 如要進一步提純，則用第二峰再過DEAE—纖維素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脫，洗脫下來的蛋白液即為IgG。
也可以按以下操作方法進行：
⑴ 以18％硫酸鈉（W/V）提取一次，再以14％的硫酸鈉提取一次。
⑵ 將粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入無水硫酸鈉，離心。再將上清按5％加入無水硫酸鈉，離心。將兩沉淀溶解、混合，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中4℃透析，直至無SO42-為止。
⑶ 離心將上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
⑷ 過SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脫，收集洗脫液，取第二峰即為雞IgG。