標(biāo)記抗體的免疫放射技術(shù)(IRMA)

（二）放射免疫檢測(cè)與免疫放射檢測(cè)(即IRMA與RIA)的區(qū)別

見(jiàn)表13－4。

表13－4 IRMA與RIA的區(qū)別

特異性抗體的制備，質(zhì)量要求及¹²⁵I標(biāo)記方法與RIA基本相同�？贵wIgG分子中含有多個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)過(guò)碘化反應(yīng)后，不影響其免疫學(xué)活性，并能結(jié)合上較多的碘原子，標(biāo)記物的比放性高，克服了RIA中某些抗原不易標(biāo)記，或在標(biāo)記過(guò)程中容易發(fā)生化學(xué)或放射性損傷等缺點(diǎn)。同時(shí)純化的抗體比抗原的純品來(lái)源更為豐富。標(biāo)記抗體的方法比較單一，也易于掌握，不同于標(biāo)記抗原，每一種抗原必須標(biāo)記一次，且抗原復(fù)雜，多種多樣，標(biāo)記方法也多種多樣。如果將抗體分子酶解成Fab片段，形成單價(jià)抗體，再進(jìn)行標(biāo)記，這樣其敏感性將顯著高于一般的IRMA。

免疫吸附劑是將高純度的抗原連接在固相載體上而制成。所用固相載體要求對(duì)抗原的結(jié)合力強(qiáng)，對(duì)非特異性蛋白質(zhì)的吸附性能低，且具有高度的分散性，這樣才能大量地結(jié)合特異性抗體。一般采用重氮化的纖維素、溴化氰化的纖維素、瓊脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠和玻璃粉等作為抗原吸附劑的固相載體。

近年來(lái)發(fā)展建立的雙抗體夾心IRMA法，用固相抗體代替抗原免疫吸附劑，反應(yīng)后形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗滌即可除去游離的剩余標(biāo)記抗體，簡(jiǎn)化了分離步驟，并保證了較高的特異性。

固相抗體的制備方法有兩種：一種是物理吸附法，將塑料小珠浸泡在稀釋的抗體中，用前經(jīng)過(guò)洗滌即可�；蛘邔⒖贵w吸附在塑料試管中；另一種是采用化學(xué)連接法，將抗體較牢固的結(jié)合，這樣洗滌時(shí)不易脫落，塑料小珠浸泡的條件是50mMol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液，抗體的濃度為IgG 0.1μg/ml～100μg/ml。塑料試管吸附抗體的條件是抗體濃度0.1μg/ml～100μg/ml 37℃、4h～6h或4℃ 24h。

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，可分為以下幾種類(lèi)型。

1．直接IRMA法 將待測(cè)抗原與過(guò)量的標(biāo)記抗體進(jìn)行溫育，使二者結(jié)合。然后加入固相抗原免疫吸附劑再次溫育，吸附游離的標(biāo)記抗體。離心去除沉淀物，測(cè)定上清液中放射性強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可得知待測(cè)樣品中的抗原含量。

2．雙抗體夾心IRMA法 在待測(cè)抗原內(nèi)依次加入固相抗體(或?qū)⒋郎y(cè)品直接加入抗體包被管內(nèi))和標(biāo)記抗體，反應(yīng)后形成固相抗體(Ab_l)－抗原－標(biāo)記抗體(Ab₂)復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合的游離標(biāo)記抗體。測(cè)定固相抗體或載體上免疫復(fù)合物的放射活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得待測(cè)得抗原量。此法僅適用于檢測(cè)有多個(gè)抗原決定簇的多肽和蛋白質(zhì)抗原。

3．間接IRMA法 此法是在上述雙抗體夾心法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改良為¹²⁵I標(biāo)記Ab₂的抗體，反應(yīng)形成的固相抗體(Ab₁)－抗原－Ab₂－標(biāo)記抗體(^﹡Ab₃)的四重免疫復(fù)合物。其中標(biāo)記抗體(^﹡Ab₃)可做為通用試劑，由于同種Ab₂的各種IRMA，省去了標(biāo)記針對(duì)不同抗原的特異性抗體。

4．BAS－IRMA法 是將生物素－親和素系統(tǒng)引入免疫放射分析，建立了新一代IRMA。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是使用生物素的抗體和以¹²⁵I標(biāo)記親和素為示蹤劑，可以通用于甾體類(lèi)、甲狀腺素、前列腺素等多種分子物質(zhì)的檢測(cè)。固相半抗原結(jié)合物經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇處理，結(jié)合非常牢固，可長(zhǎng)期保存；反應(yīng)和測(cè)定在同一試管內(nèi)完成，操作十分簡(jiǎn)便，適用于IRMA技術(shù)自動(dòng)化檢測(cè)。