免疫球蛋白提取 (Immunoglobulin isolation)：蛋白定量技術(shù)

（一）雙縮脲測定法

1．原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強(qiáng)，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測出毫克水平。

2．試劑配制

硫酸銅（CuSO₄·5H₂O） 1.50g

酒石酸鉀鈉 5.00g

H₂O 500.0ml

10％氫氧化鈉（不含硫酸鈉） 300ml

H₂O 加至 1 000ml

此溶液可長期保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。

3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時(shí)須首先采用凱氏定氮法測定牛血清白蛋白制品中實(shí)際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1％的濃度。

⑵ 將1％的牛血清白蛋白按表進(jìn)行稀釋：

表 牛血清白蛋白稀釋方法表

注：1％牛血清白蛋白，經(jīng)凱氏定氮測定含純蛋白為80％。

⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測3次，求其平均值。

⑷ 以OD值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4．樣品測定

⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1﹕10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。

⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。

⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對照。

⑷ 測OD₅₄₀值。

⑸ 根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。

注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時(shí)間均有差異，一旦標(biāo)準(zhǔn)曲線制定后，樣品的測定則必須與標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的條件一致，否則結(jié)果有差異。

（二）紫外光譜吸收法

1．原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光區(qū)的吸收特點(diǎn)而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測到微克水平，操作簡單，不需要加各種試劑，測完后，樣品可回收。

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。

⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對照。

⑶ 測各管OD₂₈₀值。

⑷ 以OD₂₈₀值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3．樣品測定

將待測樣品以鹽水適當(dāng)稀釋，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之間，以生理鹽水為對照，測OD₂₈₀值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量。

（三）Folin酚法

1．原理 蛋白質(zhì)中的酪氨酸與色氨酸和Folin酚試劑中的磷鎢酸、磷鉬酸作用后，在堿性條件下不穩(wěn)定，被還原成藍(lán)色的化合物（鉬藍(lán)）。因此通過比色即可測知標(biāo)本中的蛋白含量。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、靈敏度高，且不受溶液中脂多糖的干擾。

2．試劑

試劑甲：

A液：Na₂CO₃ 10.00g

NaOH 2.00g

酒石酸鉀鈉（或鉀鹽鈉鹽）0.25g

混合、溶于500ml蒸餾水中。

B液：CuSO₄·5H₂O 0.5g

H₂O 100.00ml

用前將A液50份與B液1份混合即為試劑甲。

試劑乙：

于磨口回流瓶加入下列試劑

Na₂WO₄·2H₂O 100.00g

NaMoO₄·2H₂O 25.00g

H₂O 700.00ml

85％H₃PO₄ 50.00ml

濃HCl 100.00ml

按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：

硫酸鋰 150.00g

H₂O 50.00ml

溴水 數(shù)滴

開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色微帶綠色（如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴步驟）。稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色瓶保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH液滴定，以酚酞為指示劑，然后適當(dāng)稀釋（加水約1倍）使最終濃度為1mol/L。

3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

⑴ 取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸餾水中，使成250μg/ml。

⑵ 按表稀釋。

表 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋方法

⑶ 每管加試劑甲5ml，混合后室溫放置10min，再加0.50ml試劑乙（即Folin酚試劑），立即搖勻（否則顯色降低）。

⑷ 30min后測OD₆₅₀nm。

⑸ 以OD為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4．樣品測定

⑴ 待測樣品1ml（適當(dāng)稀釋至約含25μg－250μg/ml）。

⑵ 加試劑甲、乙。

⑶ 比色、測OD₆₅₀值。

⑷ 查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求蛋白含量乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的蛋白含量。

（四）紫外分光測定法

A^1%_1cm＝13.8（IgG）(280nm)

A^1%_1cm＝14.5(IgM)(280nm)

蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45OD₂₈₀－0.74OD₂₆₀ （此為經(jīng)驗(yàn)公式，即以不同濃度的蛋白質(zhì)和核酸混合測定的數(shù)值所建立的）。