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微生物實驗步驟繁多，很容易出錯，奮斗在檢測一線的童鞋們，你遇到過實驗空白板長菌的情況嗎？你又是怎么溯源的呢？是生理鹽水的問題，還是試管的問題，或是平皿的問題，或是環(huán)境的問題......到底該從哪里查起呢？別急，今天小編分享一篇菩提老師的佳作，我們一起來學習一下吧！
空白對照平板上又生長菌落，到底怎么溯源？
一、方法原理：
采用頭腦風暴法（拍腦袋想，紙上談兵）和邏輯學方法進行簡單推理判斷。一邊找污染源，一邊在找的過程中消除掉一些污染源。在順序排除污染源時，可以為下一步做鋪墊，消除掉一些絆腳的可能性，從而排除起來更順暢。查找其他步驟建立良好基礎也是為了最終目的服務，最終目的就是消除所有潛在污染源。這里很佛系的講，找到或沒找到污染源頭都可以，不必太糾結。
二、建立假設（越詳細越好），還原“案發(fā)現(xiàn)場”。
假設按照GB 4789.2-2022進行菌落總數(shù)計數(shù)，操作過程如下：
（一）、稱樣、均質，制備濃度0.1g/mL的樣品勻液B。
超凈臺通風，開著照明燈。點燃酒精燈，在火焰周圍稱樣：稱取樣品A25.0g，入到1L的均質袋里，同時把滅菌好的225mL磷酸鹽緩沖溶液，也加入到1L的均質袋里，總體積250mL，封口，計為樣品勻液B。
均質袋拿出超凈臺，放入桌面上的均質器內，開啟均質器拍打均質袋1min。取出均質袋，放入超凈臺內，放在均質袋支架上。
（二）、10倍梯度稀釋法稀釋樣品和制備空白對照。
超凈臺通著風，酒精燈燃著，在火焰周圍開啟均質袋口，用1mL移液器裝上吸頭盒里面的1mL規(guī)格的移液器吸頭，開始10倍梯度稀釋。
吸取1mL樣品勻液B（0.1g/mL），加入預先滅菌過的18mm×150mm試管中（裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩沖溶液），得到樣品勻液C（0.01g/mL）。
同理：吸取1mL樣品勻液C，加入預先滅菌過的18mm×150mm試管中（裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩沖溶液），得到樣品勻液D（0.001g/mL）。
...此為10倍梯度稀釋法原理，如果要稀釋n個10倍管（n≥3），按照同理往下即可。暫時認為樣品勻液B、C、D濃度就夠用了。
（三）、傾注平板法制樣品皿和空白對照皿。
預先準備8個滅過菌的空培養(yǎng)皿、1瓶200mL左右的熔化的PCA培養(yǎng)基保溫在水浴48℃中�；靹驑悠穭蛞築、C、D。
分別取1mL樣品勻液B，加入到空白皿1、2，
分別取1mL樣品勻液C，加入到空白皿3、4，
分別取1mL樣品勻液D，加入到空白皿5、6，
分別取1mL磷酸鹽緩沖溶液，加入到空白皿7、8。
傾注PCA培養(yǎng)基至1~8皿，每皿20mL，冷卻、凝固。這樣，裝有樣品的皿分別是皿1、2、3、4、5、6，里面的濃度分別為0.1g/mL,0.01g/mL,0.001g/mL；皿7、8為空白對照皿。
（四）、培養(yǎng)、計數(shù)。
將皿1~8，倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)48h。菌落計數(shù)。
（五）、發(fā)現(xiàn)空白對照皿中有菌落污染。
假設發(fā)現(xiàn)：1、很多菌，比如幾十個以上。
假設發(fā)現(xiàn)：2、皿7菌落數(shù)0，皿8菌落數(shù)1。意思菌很少。
三、空白污染來源可能性的理論分析：
（一）、要進行溯源性調查，要了解幾個概念和相互關系。
1.概念：充分條件，必要條件，充要條件。
2.相互關系：
假設A是條件，B是結論，設C、D分別為A、B所描述對象的集合，則有下列定義和推論：
（1）由A可以推出B，由B可以推出A，則A是B的充分必要條件（此時C等于D）；
（2）由A可以推出B，由B不可以推出A，則A是B的充分不必要條件（此時C包含于D，且不相等）；
（3）由A不可以推出B，由B可以推出A，則A是B的必要不充分條件（此時D包含于C，且不相等）；
（4）由A不可以推出B，由B不可以推出A，則A是B的既不充分也不必要條件（此時C不包含D，D也不包含C）。
（二）、如果（一）中充分條件，必要條件，充要條件相互關系太抽象，想不明白的話，可以參考具體事例進行理解。
例如：空白對照皿中污染（以后簡稱：空白污染）和污染來源之間的關系。
判斷1：假如滅菌鍋滅菌不徹底，那么空白肯定污染（理論上）。
判斷2：假如移液器引入雜菌，那么空白肯定污染（理論上）。
理解1：觀察判斷1和判斷2，我們發(fā)現(xiàn)，只要[滅菌鍋和（/或）移液器]引入污染，都會導致最終空白污染，所以（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的充分條件之一。
理解2：空白污染，不能推出滅菌鍋滅菌不徹底。
因為假設滅菌鍋滅菌徹底，其他環(huán)節(jié)污染，也能導致最終空白長菌。所以（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的非必要條件。
理解3：綜合理解1和理解2，（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的充分非必要條件。
（三）、弄清楚空白污染（結果）和各個環(huán)境引入雜菌（污染的可能性，條件）之間的關系，我們就可以進行推斷，也就是溯源性調查。
還有一些隱藏的條件如：空白對照皿中污染的菌不是憑空產生的（因為微生物不會憑空出現(xiàn)），它只會從我們做實驗的操作過程的某一個或多個甚至極端到全部環(huán)節(jié)引入。又因為空白污染的來源很多，某一個污染都只是空白污染的充分非必要條件（一個源引入污染或多個源引入污染，都會導致最終現(xiàn)象-空白污染）。
我們只要把所有的污染來源都查到抓到一起，把所有的污染來源看成一個整體，那么這個整體和空白污染就構成了充分必要條件。這其中存在沒有引入污染的，也藏著1個或多個污染來源。我們的目的就是抓到（如果可能）并消除污染來源，使以后不再發(fā)生。
（四）、（三）中提到“我們的目的就是抓到（如果可能）并消除污染來源，使以后不再發(fā)生�！边@里對如果可能進行解釋。
我們溯源調查采用的是通過假設、重復實驗驗證這樣的一個方法，這是有別于真實發(fā)生了污染的那次實驗，時間和條件都有變化，是一種情景還原模擬。
重復試驗有時候能重復出來，比如設備某一個地方污染，再去檢測還能檢測到菌。
重復試驗有時候不能重復出來，比如檢測員污染那次手上帶了菌，情景再現(xiàn)時，消毒和操作都嚴格了，重復不出來了。所以針對這一現(xiàn)象我們要提醒做重復實驗的人員，讓他盡量還原上一次的情況，不必太認真也不必太放松，越接近上一次的情況模擬效果越好。
重復試驗的可能出現(xiàn)和可能不出現(xiàn)的不確定性，讓我們要我們適當進行變通，由原來找到污染來源并消除，改成努力尋找污染來源，如果抓不到，退而求其次，只要能消除污染來源，通過后續(xù)驗證，發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象不在出現(xiàn)，也可以認為達到了溯源調查的目的。
這個地方一定要想通，否則可能造成一種高尚的自虐行為。這一點要特別提醒檢測員，是因為我們特殊的職業(yè)習慣（趨近完面和強迫癥），檢測人員越嚴謹認真，有時候容易鉆牛角尖，找不到污染來源時，可能被嚴謹和認真“反噬”，走火入魔，吃不好睡不好，整個人都不好了。
四、頭腦風暴法列出可能的污染來源：
回看 “二、假設條件（越詳細越好）”寫各種設備及操作過程較為詳細，這一點在溯源性調查中非常重要。我們要建立機制尋找較為全面的污染來源。
作為微生物單一菌體肉眼不可見的特點，污染的來源藏在每一個細節(jié)里，所以進行頭腦風暴時，一定要觀察入微，調查仔細，不放過任何的可能性，簡單的思想就是：懷疑一切。
如果想象力不很強大的人，平時可以多練習冥想，提高自己想象力。也可以通過回憶檢測過程、紙上談兵模擬推演檢測過程來幫助我們還原一個近似真實的“案發(fā)現(xiàn)場”。
簡單風暴如下（因為每個人的操作習慣及每一次偶然事件形成的特殊性，每個人要根據自己的情況進行仔細進行）：我們按檢測過程進行規(guī)律性的瞎猜。
1.滅菌鍋：
1.1、滅菌不徹底，滅完還有菌活的；
1.2、其他一切詭異的只有想不到沒有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
2.超凈臺：
2.1超凈臺過濾效力下降，風中帶菌。
2.2其他一切詭異的只有想不到沒有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
3.超凈臺內部操作不當：
3.1沒開風。
3.2風力太小，亂流。
3.3超凈臺沒擦拭，環(huán)境惡劣。
3.4操作過程中離酒精燈遠。
3.5操作過程移液器帶菌污染。
3.6操作過程中拿進拿出樣品污染影響了環(huán)境造成污染。
3.7人帶進去菌污染。
3.8其他一切詭異的只有想不到沒有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
4.培養(yǎng)箱內造成的污染。
4.1風太大，吹進去。
4.2皿太濕，菌爬進去。
4.3培養(yǎng)箱環(huán)境惡劣，只要進去就有菌污染的小概率奇跡事件存在。
4.4其他一切詭異的只有想不到沒有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
5.其他：
5.1槍頭不新鮮。
5.2槍頭盒不新鮮。
5.3皿滅完濕漉漉的沒吹干，菌爬進去了。
5.4其他一切詭異的只有想不到沒有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在
五、污染源調查要充分考慮順序性：
做事有序，處理事情就顯得簡單，大腦處理起來也愉悅，同樣溯源性調查時，充分利用分類學，真相會相對容易發(fā)現(xiàn)。
所以枚舉時，要充分考慮順序性。盡可能分塊進行頭腦風暴，一方面不容易漏掉，一方面也有利于我們回頭檢查自己是否漏掉了一些細節(jié)性的部分，化整為零，逐一擊破。相反，雜亂無章的亂想是不科學的，擾亂了自己的心緒，也容易漏掉一些可能性。
另外，順序條理的想問題，就把隨機性變成了一種特殊性，更好找規(guī)律。這在消除時也有幫助。
六、提出消除污染來源的試驗方案：
經過充分、有序的找到污染來源后。我們可以按從流程的源頭往后重新重復試驗和排查。采用排除法。
我們做微生物實驗最重要的概念之一“無菌概念”。也許無菌概念太抽象，那么我們反過來，提出“有菌概念”。意思整個環(huán)境都是有菌的，這就是有菌概念。那么要想獲取無菌的環(huán)境，只有在有菌的環(huán)境中撕開一個口子，制造無菌環(huán)境。
（一）首先，起點定在滅菌鍋這里（如果煮沸的培養(yǎng)基就不是這里了，沒說盡的事情自己靈活掌握），滅菌鍋是“潔凈之源”，重復滅菌看滅菌鍋滅菌充分不充分，由于滅菌后驗證單獨不好執(zhí)行。就考慮和培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基聯(lián)系在一起進行捆綁驗證。意思就是沒有污染就都算合格，有污染再分別調查看是哪個污染。
同時重復實驗時考慮培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、移液器吸頭等是否有引入污染的可能性，都通過重復實驗和簡單對比進行。
具體操作：準備100mL的三角瓶，每瓶配30mL的固體培養(yǎng)基，如此配10瓶，放在滅菌鍋的不同位置和層之間，按照之前的滅菌方式滅菌（不要過嚴也不要放松，目的是盡可能的還原污染時候滅菌的情況）進行滅菌，滅菌后凝固了直接放培養(yǎng)箱里面36℃培養(yǎng)48h。
（二）滅菌鍋滅菌不徹底和培養(yǎng)箱的污染可能性的排查。
培養(yǎng)后觀察結果，再沒有看到皿時，會有2種可能：沒長菌和長菌。
1.沒長菌。
認為培養(yǎng)箱、滅菌鍋是沒有污染的，繼續(xù)下一步調查。如果對一次試驗不放心，可以重復此實驗3~5次，都沒有問題則認為這步驟無污染。
2長菌。
認為滅菌鍋、培養(yǎng)箱之間至少一個環(huán)節(jié)造成污染，為了區(qū)別是滅菌不充分還是培養(yǎng)過程進去的，滅完菌后讓三角瓶適當干燥后，直接室溫放置（培養(yǎng)）48h，從而可以區(qū)分。另外需要注意的是，如果瓶子培養(yǎng)基菌很多，表面、內部都有，那么可以認為是滅菌不徹底，因為一方面環(huán)境空氣中要進入三角瓶不容易（有封口膜封口），就算進入數(shù)量也少，要進入培養(yǎng)基內部可能性幾乎不可能，所以這時候重點就放在驗證滅菌鍋滅菌效果上，比如使用生物指示劑驗證。
（三）滅菌鍋已確認污染來源情況并進行了消除后，開展超凈臺內污染可能性的排查。
針對“2.1超凈臺過濾效力下降，風中帶菌”，做沉降菌試驗，看看吹出來的風是不是有污染。這時候順序排查的優(yōu)勢就出來了，只有鍋好的，培養(yǎng)基滅完是無菌的，沉降菌出現(xiàn)菌才能說明排風有問題，當然同時要注意排除人的污染性。
做沉降之前，超凈臺可以進行一次擦拭和清潔，這樣如果沒有污染了也好，因為我們找到或找不到污染源都不要緊，重要的是以后不再出現(xiàn)這個污染的現(xiàn)象。
針對“超凈臺內部操作不當”的原因，要考慮人為原因，要建立無菌概念，以及可以幾個人一起操作或進行外部培訓等，消除個人操作的一些陋習。從而達到反復實驗也不污染，才能上崗，總之微生物基礎還需要加強。
超凈臺沒問題了，就去考慮培養(yǎng)箱的問題。
七、總結一下污染物溯源調查的思路：
污染物溯源調查沒有定法，腦子要活絡，一方面要非常熟悉檢測流程和建立關鍵控制點，同時要充分考慮被污染的每一個環(huán)節(jié)，前后推敲，找出盡可能多的污染來源。在設想污染可能性的起始階段，要放下“我沒有做錯，我沒污染”的思想包袱，要懷疑一切，假設每個細節(jié)都有污染，我們通過試驗去證明是否有污染，因為實踐是檢驗真理的唯一標準，真理沒有經過實踐驗證，都可能是謬誤。這是建立在我們唯物主義價值觀以及認為世界是客觀存在、以及客觀存在是正確的統(tǒng)一認識基礎上的（這個認識從牛頓時代才建立的）。
理出一個排除的思路，盡量按照順序、分塊、化整為零的方式進行，充分考慮各種可能性之間的如關聯(lián)、排他等內在邏輯關系。排除過程中嚴謹推斷，不能遺漏。
同時還要考慮主觀能動性，有些地方單一搞不了，那就分分合合，怎么方便怎么能達到最終消除污染就行。
這樣一步一步走下去，最終找到真相，從而消除空白污染。
