應(yīng)包括20℃-25℃時的pH,并應(yīng)觀察以下內(nèi)容:加入培養(yǎng)基的量和(或)瓊脂層的厚度、顏色、透明度、是否存在肉眼可見的雜質(zhì)、凝膠穩(wěn)定性/黏稠度(一致性)、濕度。
滅菌前后都應(yīng)測定pH,采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測定液體培養(yǎng)基的pH,固體培養(yǎng)基可用平頭電極或者連接微型探頭的電極測定pH,測量時盡量使培養(yǎng)基溫度降到20℃-25℃,校正通常用接近40g/L的氫氧化鈉或者1mol/L的鹽酸。
1.污染檢測
在每批制備好的培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)選取部分樣品進(jìn)行污染測試。
2.質(zhì)控菌株
質(zhì)控菌種應(yīng)具有穩(wěn)定特性,能代表其種并能有效地證明實驗室特定培養(yǎng)基的最佳性能。測試菌種應(yīng)可溯源至國家或國際公認(rèn)的菌種收藏中心,也可以是實驗室自己分離的具有良好特性的菌種,但必須對照標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定。實驗室應(yīng)檢測和記錄儲存菌株(stock culture)的相關(guān)特性,新復(fù)蘇的菌種可能會有非特異性反應(yīng)。最好使用從食品中分離的菌種。
培養(yǎng)基的質(zhì)控菌種應(yīng)具備以下性能:具典型反應(yīng)的強陽性菌種;弱生長的陽性菌種(選擇更敏感的菌種);無生化反應(yīng)的菌種;完全抑制菌種。
3.質(zhì)控方法
國際食品微生物委員會和培養(yǎng)基菌種衛(wèi)生工作組(WPCM)介紹了培養(yǎng)基評估用測試菌種的有效收集方法。
(1)即用培養(yǎng)基和試劑
商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠家如果經(jīng)過IS0 9001和ISO 9002體系認(rèn)證或滿足相應(yīng)質(zhì)量要求,應(yīng)向使用方提供資質(zhì)證明。這時,使用者就不必對培養(yǎng)基進(jìn)行大量的測試工作,但必須保證其儲存條件。
(2)采用商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基
按ISO/TS 11133-1: 2009 《食品和動物飼料的微生物學(xué) 培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)指南第1部分:實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》的要求,除了對每批制備好的培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測試外,還應(yīng)用實際樣品進(jìn)行檢測,以更好地保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。對于不含指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基,只需用陽性測試菌種進(jìn)行測試。對于含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基,必須使用能證明其指示或選擇作用的菌種進(jìn)行試驗。對于復(fù)合培養(yǎng)基,即需要加入添加成分的培養(yǎng)基,要用具備上述性能的菌種逐批進(jìn)行檢驗。對實驗室制備的需加入添加成分的制成培養(yǎng)基同樣適用。
(3)按照培養(yǎng)基配方制備的培養(yǎng)基
建議除了按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)基品質(zhì)測試外,還要用改良的Miles-Misra技術(shù)、螺旋平板技術(shù)或菌落總數(shù)技術(shù)進(jìn)行測試,以監(jiān)控基礎(chǔ)材料的質(zhì)量、培養(yǎng)基性能和實驗室內(nèi)部的配制規(guī)范。實際上,食品中包含有應(yīng)激反應(yīng)的微生物,還應(yīng)考慮到培養(yǎng)基在應(yīng)激細(xì)菌恢復(fù)方面的適用性。
實驗室可采用半定量和定量技術(shù)對固體、液體培養(yǎng)基的性能進(jìn)行測試,在多數(shù)情況下能滿足對培養(yǎng)基性能測試的要求。
對于特殊情況,如評價一種新的培養(yǎng)基或一個新的生產(chǎn)商的產(chǎn)品等,應(yīng)采用定量測試法。
1.固體培養(yǎng)基
應(yīng)用于固體培養(yǎng)基質(zhì)控程序的技術(shù)大都依靠菌落計數(shù)。主要應(yīng)用的技術(shù)有:傾注法、涂布法、旋轉(zhuǎn)涂布法、改良的Miles-Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。這些方法作為食品實驗室的日常方法得到了國際公認(rèn)。由于傾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中經(jīng)常使用,這里不再介紹,著重介紹一下改良的Miles -Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。
(1)改良的Miles-Misra方法
改良的Miles-Misra方法是通過測試培養(yǎng)基的生長率(productivity ratio, PR)來檢查培養(yǎng)基的性能,通常與對照培養(yǎng)基相比。對照培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)是富含營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基,如:胰酪胨大豆瓊脂。
該方法步驟如下:
①將試驗菌株的過夜培養(yǎng)物用緩沖蛋白胨水10倍梯度稀釋。
②將試驗和對照培養(yǎng)基做成4mm厚的平板,并使平板表面干燥。
③從最高稀釋度(如10-5)開始,分別滴1滴稀釋液于試驗平板和對照平板標(biāo)記好的區(qū)域。
④每個稀釋度各取4滴分別加入4個試驗和對照培養(yǎng)基,每1滴的涂布超過四分之一平板,并用涂布器從高稀釋度開始涂布,37 ℃培養(yǎng)18h。
⑤對數(shù)量和菌落形態(tài)進(jìn)行評價。
評價方法,即按下列方式計算:
PR=Ns/No
式中:
PR--生長率;
Ns-試驗培養(yǎng)基的菌落數(shù);
No-對照培養(yǎng)基的菌落數(shù)。
示例:在10-3稀釋度,試驗培養(yǎng)基上為20個菌落,對照培養(yǎng)基上為25個菌落,則PR=0.80。
(2)半定量劃線法
使用本方法時,所有測試培養(yǎng)基應(yīng)干燥到相同程度,且整個步驟應(yīng)標(biāo)注化,以便于比較同批次培養(yǎng)基的測試結(jié)果。
用1uL接種環(huán)劃線平板。在A區(qū)用接種環(huán)按0.5cm的間隔劃4條平行線,按同樣的方法:B區(qū)和C區(qū)劃線,最后在D區(qū)內(nèi)劃一條線。按標(biāo)準(zhǔn)方法所規(guī)定的培養(yǎng)時間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
通常情況下用同一接種環(huán)對A區(qū)~D區(qū)進(jìn)行劃線,在不同區(qū)域劃線時不需對接種環(huán)滅菌。但為了得到低生長指數(shù)G1,在A區(qū)和B區(qū)接種應(yīng)更換接種環(huán)或?qū)ζ溥M(jìn)行滅菌。
評價方法:培養(yǎng)后,評估菌落的形狀、大小和密度,并計算生長指數(shù)G1。每條有菌落生長的劃線記作1分,每個培養(yǎng)皿上最多為16分。如果僅一半的線有菌落生長,記作0.5分。如果劃線上沒有菌落生長或生長量少于劃線一半,則記作0分。記錄每個平板的得分總和便得到G1。例如:菌落在A區(qū)和B區(qū)全部生長,而在C區(qū)有一半線生長,則G1為10。
目標(biāo)菌的生長指數(shù)G1大于6時,則判定培養(yǎng)基可接受。非選擇性培養(yǎng)基的G1值通常更高。目標(biāo)菌應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長,而非目標(biāo)菌的生長應(yīng)部分或完全被抑制。
(3)定性劃線法
該方法只是定性測試,劃線培養(yǎng)后,按照要求進(jìn)行打分,得分是指示性的,可用作固體培養(yǎng)基性能測試的補充。
取1uL測試菌株培養(yǎng)物在測試培養(yǎng)基表面劃平行直線,可同時在一個平板上接種多個菌株,但劃線不能交叉,然后按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
評價方法:培養(yǎng)后按以下方法進(jìn)行平板生長評估:0表示無生長, 1表示生長,2表示良好生長。目標(biāo)菌得分應(yīng)為2,并且有典型的菌落外觀、大小和形態(tài)。非目標(biāo)菌的生長應(yīng)該部分或全部被抑制。
2.液體培養(yǎng)基
為確定液體培養(yǎng)基的生長率,應(yīng)接種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物。下面介紹的是用定量、半定量和定性方法評估生長率和選擇性的方法。所推薦的這些方法都是通過將液體培養(yǎng)基以傾注或劃線方式接種到瓊脂平板上培養(yǎng)后,計數(shù)或計算液體培養(yǎng)基分?jǐn)?shù)而得出其生長數(shù)量的。對于液體培養(yǎng)基定性測試方法,則通過肉眼觀察來實現(xiàn)。
目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的定量稀釋法步驟如下:
選擇液體培養(yǎng)基10mL/管待檢。
接種目標(biāo)菌:將少量測試菌株培養(yǎng)物(每管10CFU~100CFU)接種測試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯,混勻。
接種非目標(biāo)菌:將大量測試菌株培養(yǎng)物(每管大于1000CFU)接種測試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯,混勻。
接種目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的混合培養(yǎng)物:用少量目標(biāo)菌(每管10CFU ~100CFU)測試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯。同時每管接種大量非目標(biāo)菌(每管大于1000CFU),混勻。
稀釋劑和運輸培養(yǎng)基中目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的接種:接種測試菌于稀釋劑中(每管100CFU~1000CFU),混勻。
按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
結(jié)果的計算和解釋:
(1)計算目標(biāo)和非目標(biāo)微生物的菌落數(shù),用生長率(PR)和選擇因子(SF)進(jìn)行結(jié)果的解釋。
目標(biāo)微生物的PR不應(yīng)小于0.1 (因生長的不同不能超過1個數(shù)值).
非目標(biāo)微生物的SF至少應(yīng)達(dá)到2。
SF的計算見式 :
SF=Do-Ds
式中:
Do-在參考培養(yǎng)基上能生長至少10個菌落的最高稀釋度;
Ds-在測試培養(yǎng)基上顯示相應(yīng)生長的最高稀釋度;
SF、Do和Ds用Ig表示。
例如:Do=lg104=4.0, Ds=lg103=3.0,選擇因子SF=1.0。
混合菌株中, 目標(biāo)菌的生長不應(yīng)受到非目標(biāo)菌的抑制,即目標(biāo)菌始終應(yīng)為優(yōu)勢菌群。
(2)在混合菌株中目標(biāo)菌數(shù)量的最低值及非目標(biāo)菌數(shù)量的最高值應(yīng)符合以下要求:目標(biāo)菌的最低濃度應(yīng)達(dá)到10CFU/mL ~100CFU/mL;在選擇性肉湯培養(yǎng)物中非目標(biāo)菌的最高濃度不應(yīng)超過104CFU/mL.
(3)稀釋和運輸培養(yǎng)基不應(yīng)引起目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌數(shù)量的減少或增加。菌株在這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的數(shù)量變化應(yīng)在最初計數(shù)的±50%的范圍內(nèi)。