概述

化學(xué)發(fā)光作為一種分析工具的吸引之處就在于檢測的簡單性。化學(xué)發(fā)光的實(shí)質(zhì)是自身發(fā)光，這意味著化學(xué)發(fā)光的分析測試儀器只需要提供一種可以檢測光信號(hào)和紀(jì)錄結(jié)果的方法就可以了。自發(fā)光檢測儀需要一個(gè)閉光的樣品室和光檢測器。最簡單的便是相片紙或X光片，甚至視覺檢測器都可以。

化學(xué)發(fā)光檢測方法的簡單性使得它的應(yīng)用很簡單并且完全可以自動(dòng)化。但是它的靈敏度又是怎么樣的呢？化學(xué)發(fā)光有如下兩個(gè)內(nèi)在的優(yōu)勢：

1．絕大多數(shù)的樣品沒有“背景”信號(hào)，如它們自身不發(fā)光。

2．化學(xué)發(fā)光的檢測不是一個(gè)比例測試，這是與熒光和吸收或比色測試不同的。在熒光測試中，具有小的Stokes Shift的熒光基團(tuán)非常難檢測。熒光很難從激發(fā)波長中分辨出來。

另外一個(gè)問題是，特別在樣品是渾濁的情況下有一部分雜光會(huì)進(jìn)入到檢測器。

在吸收光測試上，其靈敏度受到限制的根本因素是需要在兩個(gè)相對(duì)較強(qiáng)的信號(hào)之間去區(qū)分一個(gè)較小的差別。

需要注意的是檢測器對(duì)光譜的敏感性近可能接近化學(xué)發(fā)光的光譜，以得到最大化的靈敏度。一般在自發(fā)光儀中的光電倍增管對(duì)藍(lán)光有最佳的反應(yīng)，對(duì)紅光的末端光譜不太敏感。固態(tài)檢測器對(duì)紅光有較好的反應(yīng)。

X光片廣泛用于記錄在尼龍膜、纖維素膜或PVDF膜上的化學(xué)發(fā)光印跡分析。但是我們需要牢記在心的是X光片僅能夠用于檢測紫外到藍(lán)光光譜范圍內(nèi)的光信號(hào)，雖然有一些特殊的光片對(duì)增強(qiáng)的綠光有敏感性。

液體樣品的檢測

有一些特定的詞來描繪化學(xué)發(fā)光檢測：靈敏度、線性和動(dòng)態(tài)范圍。每一個(gè)詞的意義如下：

1．靈敏度指的是某種東西可靠檢測的最低水平。“某種東西”是指在一個(gè)分析測試中的測試物。測試物是被標(biāo)記了一種可檢測的東西，如化學(xué)發(fā)光化合物或的一種酶。分析物也可以是一種通過與具有標(biāo)記的親合物有特異性結(jié)合反應(yīng)而檢測的物質(zhì)。所謂的可靠檢測指的是針對(duì)一個(gè)空白測試樣品，檢測器能夠重復(fù)感應(yīng)到最低水平的信號(hào)，而這種信號(hào)是由所檢測物本身產(chǎn)生的。

2．線性描述的是信號(hào)與分析檢測物濃度范圍之間的關(guān)系。理想的比例因子是常數(shù)；信號(hào)點(diǎn)與分析檢測物是一條直線關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以不是直線，如s形，仍是有用的。

3．動(dòng)態(tài)范圍指的是被檢測物濃度與信號(hào)單一模式的變換范圍。它定義的是分析的工作范圍。

你期望通過化學(xué)發(fā)光得到什么水平的靈敏度呢？答案不一定會(huì)滿足你的要求，“它是有條件的”。在很少情況下，檢測器的靈敏度或化學(xué)發(fā)光方法會(huì)是檢測的局限因素�，F(xiàn)在的檢測器可以達(dá)到很高的靈敏度。大多數(shù)情況下，而是其它的一些因素顯示了分析檢測的靈敏度。最通常的是生物成分（抗體、酶等）的非特異性結(jié)合到反應(yīng)容器和支持物的表面。例如，免疫分析，印跡實(shí)驗(yàn)，核酸雜交和其它的酶聯(lián)結(jié)合實(shí)驗(yàn)都是受制于此因素。

管和微孔板

玻璃、透明或半透明的塑料管、比色皿是化學(xué)發(fā)光測試比較理想的材料。理想的是光能夠通過一個(gè)平面然后測試，以減少邊際效應(yīng)。曲面也可以使用，如圓柱型的測試管。用不同的測試管測試比較結(jié)果，這些管必須是統(tǒng)一生產(chǎn)的，才可以比較結(jié)果。

微孔板——從化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)射出的光是各向同性的，即在各個(gè)方向上同等發(fā)射出來的。如果一個(gè)化學(xué)反應(yīng)是在透明的微孔板中的微孔中進(jìn)行，光不僅從垂直方向發(fā)散，還從水平方向發(fā)散出來。光很容易的通過各個(gè)孔之間的間隙和孔壁。光較強(qiáng)的孔就會(huì)干擾相鄰的孔。因此，化學(xué)發(fā)光測試一般不用透明微孔板。

不透明的微孔板和板條主要有兩種——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因?yàn)橛泄馕�收，所以它的信�?hào)會(huì)比白色板有很明顯的減弱（將近10倍）。因?yàn)樗�有的孔是同等比例的收到影響，所以不管他們的�?qiáng)度，定量并沒有問題。白色或黑色板的選擇，主要是基于預(yù)期檢測信號(hào)的強(qiáng)弱，白色板用于檢測較弱光的檢測，黑色板用于檢測強(qiáng)光的檢測。黑色板的另一優(yōu)點(diǎn)就是可以削弱非特異性結(jié)合所帶來的問題。

此外，白色板并不是完全同等不透明。為熒光設(shè)計(jì)的白板的白色素比用于化學(xué)發(fā)光的白板的要少的多。在熒光檢測時(shí)，每檢測一次，一般在針對(duì)一個(gè)孔，消除了相鄰孔之間的干擾。白色微孔板的好壞很容易檢測，只要在板的后面放上一只燈，然后看每個(gè)孔。如果穿過的燈光不僅僅是淡淡的，那么用于較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物的分析是會(huì)有一些問題的。

固相樣品的檢測（印跡膜）

X光片——它已經(jīng)被認(rèn)為是對(duì)固定在膜上的蛋白或核酸進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的強(qiáng)有力的工具，如Southern、Northern和Western雜交的化學(xué)發(fā)光檢測。此類商業(yè)化的產(chǎn)品已非常廣泛。

如果能夠控制好非特異性的結(jié)合，靈敏度是足夠的。如果不能很好控制，將會(huì)X光片上曝光過度。解決這個(gè)問題的最好策略是減少結(jié)合的試劑的量，例如抗體或類似物。曝光時(shí)間1到10分鐘通常是足夠顯現(xiàn)大多數(shù)的印跡。更長的很少能提高信號(hào)/背景。

關(guān)于靈敏度相對(duì)的方面來講，未得到信號(hào)并不意味著分析物的不存在。任何一種光學(xué)用膜片都有一個(gè)強(qiáng)度閾值，在這個(gè)閾值之上銀顆粒的光化學(xué)轉(zhuǎn)化才能成功。否則會(huì)失敗，稱之為“可逆失敗”。在實(shí)際操作中，化學(xué)發(fā)光信號(hào)低于閾值強(qiáng)度的結(jié)果僅是簡單的沒有記錄。更長時(shí)間的曝光也不能克服這個(gè)問題�？梢酝ㄟ^一些方法來改進(jìn)，在曝光之前如把膜片放在氫氣和氮?dú)獾幕旌蠚怏w中預(yù)閃，即用低強(qiáng)度的光短時(shí)間的照射膜片，以提高光學(xué)顆粒的光子。

CCD成像技術(shù)——最近，基于CCD的影像系統(tǒng)已成為化學(xué)發(fā)光印跡結(jié)果獲得和記錄的好工具。這些系統(tǒng)在信號(hào)測試的動(dòng)態(tài)范圍上表現(xiàn)出很好的效果。CCD的量度大小為3～4個(gè)級(jí)數(shù)，而X光片僅為1個(gè)級(jí)數(shù)。攝像時(shí)間短，并且可以獲得多個(gè)影像和容易存儲(chǔ)。雖然需要投入設(shè)備的購置費(fèi)，但是可以節(jié)省膜片和其它的投入。

設(shè)備（光電倍增管）

在發(fā)光儀上，PMT為傳統(tǒng)的選擇。它們的優(yōu)勢包括良好的靈敏度，寬廣的動(dòng)態(tài)范圍和較寬的光譜相應(yīng)。因?yàn)镻MT具有很低的暗電流，使得它們具有極佳的信噪比。

PMT有兩種基本模式——單光子計(jì)數(shù)和電流感應(yīng)。有些復(fù)合系統(tǒng)是在每秒百萬個(gè)光子以下為單光子模式，超過之后為電流感應(yīng)。

PMT單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)是超靈敏的。用這類檢測器主要是為了滿足靈敏度要求較高的測試和定量。越高要求的靈敏度，價(jià)格越高。樣品測試室必須是光密閉性非常好的。如果光太強(qiáng)會(huì)損害PMT。

PMT電流感應(yīng)系統(tǒng)也能獲得較好的靈敏度，經(jīng)常用于比單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)檢測的更強(qiáng)的光。

對(duì)于選擇何種模式的PMT檢測器，需要與你的實(shí)際需要結(jié)合起來選擇�，F(xiàn)在，這兩種檢測器的化學(xué)發(fā)光儀操作都比較簡單，靈敏度也都比較好。對(duì)此有一個(gè)正確的理解，你就可以選擇一個(gè)比較適合你的應(yīng)用的設(shè)備。

PMT主要應(yīng)用在液相中化學(xué)發(fā)光的檢測，儀器形式可以為管式和板式。其檢測結(jié)果單位值為RLU（Relative Light Unit），各個(gè)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品其對(duì)RLU的定義會(huì)有所不同。

固態(tài)檢測

光電二極管能夠感應(yīng)比光電倍增管所感應(yīng)的更強(qiáng)的光強(qiáng)度。對(duì)于那些需要測試高強(qiáng)度光的應(yīng)用，選擇這樣的檢測器比較好。然而，固態(tài)檢測器的暗電流比光電倍增管一般要高很多。解決這個(gè)問題的方法之一是通過Peltier或者是其它的熱電制冷設(shè)備冷卻固態(tài)檢測器。在0～30攝氏度范圍內(nèi)，固態(tài)檢測器的暗電流隨溫度的降低會(huì)急劇下降。冷卻的檢測器能夠整合1到100秒范圍內(nèi)所檢測到光信號(hào)而不會(huì)被暗電流所覆蓋。

CCD和其它的固態(tài)檢測器擁有以下幾個(gè)內(nèi)在的優(yōu)點(diǎn)：

1、在可見光譜范圍內(nèi)，固態(tài)檢測器有一個(gè)較好的光譜響應(yīng)。發(fā)光反應(yīng)發(fā)出紅光，甚至近紅外光。

2、CCD影像系統(tǒng)可以對(duì)不同的目標(biāo)物進(jìn)行檢測�；�本上任何一種樣品或容器都可以適用，如微孔板，細(xì)菌測試管或細(xì)胞培養(yǎng)皿，電泳凝膠和印跡膜。

3、單個(gè)PMT系統(tǒng)在測讀之前必須對(duì)樣品位置進(jìn)行定位。樣品管重復(fù)多次帶到一個(gè)固定位置，然后重復(fù)測讀。微孔板PMT測讀儀依賴于微孔之間的標(biāo)準(zhǔn)間隔，能夠按照一個(gè)預(yù)算好的位置移動(dòng)微孔板，由此微孔一個(gè)接著一個(gè)的測讀。而攝像系統(tǒng)測讀一個(gè)樣品不需要預(yù)先知道它的位置，例如膜上的一個(gè)條帶。影像系統(tǒng)能夠把樣品的濃度和位置信息給出。

4、CCD影像系統(tǒng)能夠同時(shí)獲得大量樣品的信息。如對(duì)96、384或更多數(shù)目的微孔板的數(shù)據(jù)的同步收集并不是一個(gè)奢望。固態(tài)影像系統(tǒng)可以一次就獲得整個(gè)微孔板的影像和定量。

儀器設(shè)計(jì)者或終端使用者需要注意的是影像檢測器對(duì)于微孔板樣品的檢測存在一個(gè)重大的缺陷：三維的微孔板相比于二維檢測物（如膜）會(huì)產(chǎn)生一個(gè)邊際效應(yīng)。因?yàn)楣鈴?qiáng)度按照距離平方的倒數(shù)逐漸變?nèi)�，所以把攝像頭放到盡可能離板近的地方由此可以得到最好的結(jié)果。然而，因?yàn)榭资怯猩疃�，最遠(yuǎn)孔的整個(gè)底部就可能看不到。這個(gè)孔的邊緣部分的光信號(hào)就很可能檢測不到。

提高攝像頭將削減檢測器所獲得的整體的光強(qiáng)度。幾何計(jì)算模式可以拿來應(yīng)用以彌補(bǔ)邊際強(qiáng)度的丟失，但是外圍孔的信噪比必然比中央孔的要差。

CCD應(yīng)用最普遍的設(shè)備系統(tǒng)為帶制冷CCD的化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)。為了提高檢測速度和通量，有時(shí)也把CCD應(yīng)用到高通量的板式化學(xué)發(fā)光檢測儀上。

輔助設(shè)備

大多數(shù)研究用的發(fā)光儀和發(fā)光免疫分析儀都裝有一些輔助裝置，如樣品孵育，樣品注射器，光學(xué)濾光片等。

1.、溫度控制——有時(shí)需要的結(jié)果進(jìn)行比較，會(huì)因?yàn)闇囟鹊牟煌�而收到干擾。特別是在一些酶催化的“glow”型的反應(yīng)需要幾分鐘才能達(dá)到高峰，溫度的變化會(huì)導(dǎo)致測試到的強(qiáng)度發(fā)生變化，降低分析的精確性。如果能夠控制樣品的溫度和反應(yīng)溫度的統(tǒng)一，可以使得反應(yīng)在固定條件下進(jìn)行。樣品發(fā)光強(qiáng)度可能由幾個(gè)因素造成的：溫度依賴的酶動(dòng)力學(xué)和隨后的底物化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。緩沖液的pH值加上溫度的影響可以引起信號(hào)的顯著變化。

2、單色分光和濾光片可以分離特定的波長或光譜范圍的光。在化學(xué)發(fā)光應(yīng)用中一般沒有特殊的要求，它們是不需要的。在同一個(gè)反應(yīng)體系中有兩種能夠發(fā)出不同光譜的發(fā)光物，其目的是為了分析檢測兩種不同的測試物。如在生物化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移中，就用濾光片來分析蛋白質(zhì)的相互結(jié)合。波長的選擇不免會(huì)降低檢測器上的光通過量從而倒是靈敏度的損失。

3、中性濾光片——使用中型濾光片可以是檢測設(shè)備的檢測范圍延伸2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。由特制的淺灰玻璃組成，放置于樣品與監(jiān)測器之間，這些濾鏡起到類似“太陽鏡”的作用將所有波長的光都以相同的因子進(jìn)行減弱。使用此校正因子將測量得到的光校正到“真實(shí)”的強(qiáng)度。

4、注射器可以使得底物或啟動(dòng)劑能夠以精確的時(shí)間加入。對(duì)于一個(gè)隨時(shí)間光信號(hào)產(chǎn)生變化的動(dòng)力學(xué)樣品來說，這是非常重要的。