使用質譜作小分子藥代動力學分析,即PK/MS。除此之外,這些同樣的原則也可用于生物基質中肽和蛋白的定量。
傳統(tǒng)上,在使用現(xiàn)代質譜定量之前,定量是用HPLC高效液相色譜和UV紫外檢測器實現(xiàn)的。HPLC 藥代動力學分析建立在保留時間、峰面積和紫外光譜性質的基礎上的。HPLC方法的缺點是靈敏度不夠、缺乏特異性。我們已經看到一些實例,一個化合物的確已經代謝了,然而保留時間和紫外光譜上,母離子和代謝物無法區(qū)分。這種缺少特異性的分析時不時會誤導研究者。所以在藥代動力學分析中,基于質譜的表征現(xiàn)在是一種新型的重要的工具。
質譜定量中已經被廣泛接受的方式是MS/MS定量。這種定量常通過三級四極桿或離子阱質譜實現(xiàn)。要求使用MS/MS的原因是:許多化合物有同樣的質量。當使用第一個維度即單級質譜MS去定量時,也會缺乏特異性,尤其是對于像血液那樣的復雜的基質。第二個維度的MS(即MS/MS)在大多數(shù)情況下,能夠提供唯一的斷裂。合并特異的母離子質量和唯一的碎片離子信息,可以選擇性地監(jiān)測被定量的化合物。下面我們將討論獲得和可視化LC/MS數(shù)據(jù)的方法。
獲得和可視化LC/MS的數(shù)據(jù),或稱為:質譜數(shù)據(jù)如何在一個LC/MS實驗中表達?
典型的方法,質譜被設置為掃描特定的質量范圍。在全掃描分析中,質量掃描范圍較寬;在選擇離子監(jiān)測SIM時,質量掃描范圍較窄。依賴于掃描的類型,一個獨立的質量掃描時間可以從10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可獲得許多個掃描。LC/MS數(shù)據(jù)的表示方法為:把每個質量掃描的離子流信息疊加,畫出隨時間變化的總離子流,橫軸是時間,縱軸是強度。總離子流圖非常像HPLC的紫外圖,見圖1。
下面我們將討論各種掃描的模式,和這些模式同質譜定量的關系。
最常見的LC/MS數(shù)據(jù)模式為:
(1) 總離子流圖
(2) 選擇離子監(jiān)測(SIM)
(3) 選擇反應監(jiān)測(SRM)或多反應監(jiān)測(MRM):MRM和SRM本質上是同樣的實驗模式。
全掃描分析
從藥代分析中得到的全質量范圍的總離子流圖(TIC)非常像HPLC UV圖,除了:質譜能檢測到更多的化合物,尤其是沒有紫外吸收的化合物?傠x子流是一個疊加圖,疊加了每個質量掃描的離子流。當一個小分子或小肽流出HPLC色譜柱時,相對強度上升,在TIC圖上出現(xiàn)了一個峰,橫軸是時間。每個質量的化合物都被記錄在TIC圖上。找出感興趣的化合物可能是困難的,因為許多化合物有相同的質量;衔锏奶烊毁|量不是鑒定的唯一性數(shù)據(jù)。設置一個確定的質量,可以畫出一個提取離子流圖,但這個圖的強度會比下面介紹的SIM實驗中的強度低。
(注意:TIC指的是在一段時間內采集的質量掃描數(shù)據(jù),不特指掃描范圍或質譜實驗的類型。例如,我們可以在SIM或SRM實驗中獲得TIC圖。然而,為簡單起見,我們將把這些圖稱為SIM和SRM圖,而不是SIM TIC圖。)
Selected Ion Monitoring選擇離子監(jiān)測
在選擇離子監(jiān)測中,質譜被設置為掃描一個非常小的質量范圍,典型的是一個質量數(shù)的寬度。選擇的質量寬度越窄,SIM的確定度越高。SIM圖就是從非常窄的質量范圍中得到的離子流圖。只有被該質量范圍選擇的化合物才會被畫在SIM圖中。圖1和圖2是同一個樣品的譜圖,然而它們看起來很不相同。原因是在SIM圖中,畫的是TIC圖中較少的組分。SIM圖是比TIC圖更確定的圖。
然而,SIM圖仍顯示了許多峰,不能唯一地確認我們感興趣的化合物。一個復雜的樣品(比如血清或血漿)中,這樣的圖是一個典型的SIM圖。許多化合物有同樣的質量,在ESI中還有多電荷峰也和我們感興趣的化合物有同樣的m/z值。SIM實驗比全掃描實驗更靈敏,因為質譜在一個更小的質量范圍上駐留(dwell)更長的時間。
Selected Reaction Monitoring選擇反應監(jiān)測 (SRM)
SRM被大多數(shù)科學家在質譜定量中使用,見圖3。SRM中,可以監(jiān)測一個特征的唯一的碎片離子,在很多非常復雜的基質中進行定量。SRM圖非常簡單,通常只包含一個峰。這種特征性使SRM圖成為靈敏度高且特異性強的理想的定量工具。
SRM的過程:選擇一個特征的母離子做MS/MS,在其碎片中選擇一個特征的子離子作為監(jiān)測離子?梢园裇RM理解為碎片離子的SIM。這種特征性的實驗被成為“transition”(躍遷)。