(一)實驗?zāi)康模?/span>學(xué)習(xí)細菌的莢膜染色法:
(二)實驗原理:由于莢膜與染料間的親和力弱,不易著色,通常采用負染色法染莢膜,即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色,從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上,故染色時一般不加熱固定,以免莢膜皺縮變形。
(三)實驗器材
1.活材料:培養(yǎng)3-5天的膠質(zhì)芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus,俗稱“鉀細菌”)。該菌在甘露醇作碳源的培養(yǎng)基上生長時,莢膜豐厚。
2.染色液和試劑 :Tyler法染色液:(見附二、(一)、14)、用濾紙過濾后的繪圖墨水、復(fù)紅染色液(見附二、(一)、2)、黑素(見附二、(一)、7)、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。
3.器材: 載玻片、玻片擱架, 擦鏡紙、顯微鏡等。
(四)實驗方法
推薦以下四種染色法,其中以濕墨水方法較簡便,并且適用于各種有莢膜的細菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。
1.負染色法:
(1)制片:取潔凈的載玻片一塊,加蒸餾水一滴,取少量菌體放入水滴中混勻并涂布。
(2)干燥:將涂片放在空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。
(3)染色:在涂面上加復(fù)紅染色液染色2—3min。
(4)水洗:用水洗去復(fù)紅染液。
(5)干燥:將染色片放空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。
(6)涂黑素:在染色涂面左邊加一小滴黑素,用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素,使黑素沿玻片邊緣散開,然后向右一拖,使黑素在染色涂面上成為一薄層,并迅速風(fēng)干。
(7)鏡檢:先低倍鏡,再高倍鏡觀察。
結(jié)果:背影灰色,菌體紅色,莢膜無色透明。
2.濕墨水法
(1)制菌液:加1滴墨水于潔凈的載玻片上,挑少量菌體與其充分混合均勻。
(2)加蓋玻片 放一清潔蓋玻片于混合液上,然后在蓋玻片上放一張濾紙,向下輕壓,吸去多余的菌液。
(3)鏡檢:先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。
結(jié)果:背景灰色,菌體較暗,在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。
3.干墨水法
(1)制菌液:加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端,挑少量膠質(zhì)芽胞桿菌與其充分混合,再加1環(huán)墨水,充分混勻。
(2)制片:左手執(zhí)玻片,右手另拿一邊緣光滑的載玻片,將載玻片的一邊與菌液接觸,使菌液沿玻片接觸處散開,然后以30度角,迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端,使菌液鋪成一薄膜。
(3)干燥:空氣中自然干燥。
(4)固定:用甲醇浸沒涂片,固定1 min,立即傾去甲醇。
(5)干燥:在酒精燈上方,用文火干燥。
(6)染色:用甲基紫染1—2min。
(7)水洗:用自來水輕洗,自然干燥。
(8)鏡檢:先用低倍鏡再高倍鏡觀察。
結(jié)果:背景灰色,菌體紫色,莢膜呈一清晰透明圈。
4.Tyler法
(1)涂片:按常規(guī)法涂片,可多挑些菌體與水充分混合,并將粘稠的菌液盡量涂開,但涂布的面積不宜過大。
(2)干燥:在空氣中自然干燥。
(3)染色:用Tyler染色液染5—7min。
(4)脫色:用20%CuSO4水溶液洗去結(jié)晶紫,脫色要適度(沖洗2遍)。用吸水紙吸干,并立即加1—2滴香柏油于涂片處,以防止CuSO4結(jié)晶的形成。
(5)鏡檢:先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。
結(jié)果:背景藍紫色,菌體紫色,莢膜無色或淺紫色。
(五)實驗作業(yè):
繪出Bacillus mucilaginosus的形態(tài)圖,并注明各部位的名稱
(六)注意事項
1.加蓋玻片時不可有氣泡,否則會影響觀察。
2.應(yīng)用干墨水法時,涂片要放在火焰較高處并用文火干燥,不可使玻片發(fā)熱。
3.在采用Tyler法染色時,標(biāo)本經(jīng)染色后不可用水洗,必須用20%CuSO4沖洗。