(1)在肉膏蛋白胨斜面試管上,用記號筆寫上將接種的菌名、日期和接種者。
(2)點燃酒精燈或煤氣燈。
(3)將菌種試管和待接種的斜面試管,用大拇指和食指、中指、無名指握在左手中,并將中指夾在兩試管之間,使斜面向上,成水平狀態(tài),在火焰邊用右手松動試管塞,以利于接種時拔出。
(4)右手拿接種環(huán)通過火焰燒灼滅菌(參照實驗一),在火焰邊用右手的手掌邊緣和小指,小指和無名指分別夾持棉塞(或試管帽),將其取出,并迅速燒灼管口。
(5)將滅菌的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi),先將環(huán)接觸試管內(nèi)壁或未長菌的培養(yǎng)基,達到冷卻的目的,然后再挑取少許菌苔。將接種環(huán)退出菌種試管,迅速伸入待接種的斜面試管,用環(huán)在斜面上自試管底部向上端輕輕地劃直線,勿將培養(yǎng)基劃破,也不要使環(huán)接觸管壁或管口。
(6)接種環(huán)退出斜面試管,再用火焰燒管口,并在火焰邊將試管塞塞上。將接種環(huán)逐漸接近火焰,再燒灼。如果接種環(huán)上沾的菌體較多時,應先將環(huán)在火焰邊烤干,然后燒灼,以免未燒死的菌種飛濺出污染環(huán)境,接種病原菌時更要注意此點。
二、液體培養(yǎng)基接種
液體培養(yǎng)基接種是用接種環(huán)、移液器或吸管等工具,將菌體或菌液移至試管、三角瓶等容器中的液體培養(yǎng)基中的一種接種方法。其操作與前面斜面接種基本相同,但應注意:液體培養(yǎng)基試管管口或三角瓶瓶口略向上以免培養(yǎng)液流出;加入菌體時,應使接種環(huán)與管內(nèi)壁輕輕研磨,使菌體擦下,塞好棉塞后,將試管在手掌心中輕輕敲打或輕輕搖晃三角瓶,使菌體混合均勻。
試管液體接種是將一定體積的樣品混懸液加入到盛有指定液體培養(yǎng)基的試管內(nèi),或將一定體積、按標準規(guī)定條件下培養(yǎng)過的培養(yǎng)液接入盛有指定液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)(有時是指接種環(huán)取一環(huán),或移液管移液器移取一定的體積,例如0.1mL、1mL等)。涉及試管液體接種的操作有MPN法檢測大腸菌群/大腸桿菌,以及沙門氏菌、單增李斯特氏菌的二次增菌轉接操作等。
此處以用移液器將一定體積的樣品混懸液接入到盛有指定液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)為例,具體操作如圖。
①用酒精棉消毒操作臺面。將移液器吸頭盒放入酒精燈右側,靠近酒精燈放置。將需要進行液體轉接的試管插在試管架上,置于酒精燈左邊左手附近。將移液器調至合適的刻度放于右手附近的架子上。廢物缸放于右手能觸及的范圍內(nèi)。
②點燃酒精燈,左手于酒精燈火焰附近打開移液器吸頭盒,右手持移液器用力插取吸頭兩下以防吸頭松動脫落,拔出移液器并蓋上移液器吸頭盒盒蓋。左手取待轉接液體試管,試管底部位于左手手心,移液器吸頭和試管口應在酒精燈火焰周圍的無菌區(qū)域之內(nèi)。
③將試管伸向右手。右手食指,中指,無名指握住移液器,拇指靠在移液器按鈕上,小指和掌心下緣合圍夾住試管帽并用力拔出。如果操作者的手比較小,可以靠食指無名指和小指握住移液器,拇指仍靠在液體按鈕上。而中指向外伸,靠中指內(nèi)側和食指、無名指外側夾住試管帽。將試管口和移液器吸頭靠近火焰,試管口灼燒一周,在火焰附近將吸頭剛好伸入試管口,抵住試管內(nèi)壁下側,同時按住移液器按鈕至一檔(輕微推不動)。不要將移液器吸頭伸到試管底部,而應傾斜試管使液面傾斜至試管口附近并沒過吸頭尖端。右手拇指緩慢松開,使液體緩緩吸入洗頭,注意不要吸入空氣。如果有空氣吸入,必須將液體壓回試管重新吸取。當右手拇指完全松開時,撤離移液器,注意吸頭需盡量一直圍繞在在酒精燈火焰附近,并且吸頭務必保持向下姿勢以防止液體倒流入移液器內(nèi)部引起污染。
④吸完液體后,將移液器撤離試管,移液器吸頭移到酒精燈火焰的遠離操作者的一側,將試管口在火焰上灼燒滅菌。
⑤滅菌后,右手小指迅速將試管帽蓋上,此時移液器吸頭仍然要在火焰形成的無菌區(qū)域內(nèi),不可離酒精燈火焰太遠。蓋上試管帽將試管歸位。
⑥左手取待轉接入液體的試管,右手保持移液器吸頭在酒精燈火焰附近。
⑦右手保持握移液器姿勢取下試管帽并灼燒管口。將吸頭抵靠在試管口的內(nèi)壁上,緩緩推動移液器按鈕至底(完全推至第二檔,使殘存在吸頭尖端的液體也流出)。推出液體時注意不要將吸頭深入試管底部,也不要用力推導致液體飛濺。
⑧左手將試管口靠近火焰滅菌,移液器吸頭移到酒精燈火焰的另一側。再次灼燒試管口
⑨右手保持握移液器姿勢將試管帽蓋上,將試管歸位。移取液體完畢后,按壓移液器滑動桿使吸頭脫落至廢物缸,移液器放回架子。熄滅酒精燈,將臺面消毒并收拾干凈。
相對于試管的液體接種培養(yǎng),三角瓶接種培養(yǎng)的優(yōu)勢在于通氣效果好。多見于霉菌或一些細菌的復壯培養(yǎng)或者搖床培養(yǎng)等。操作與前面提到的液體試管接種操作基本相同,最后將液體加入三角瓶的時候,三角瓶傾斜,移液器吸頭抵在三角瓶的內(nèi)壁,緩緩將液體加入,避免噴濺和氣泡,見下圖。
向肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中接種少量菌體時,其操作步驟基本與斜面接種時相同,不同之處是挑取菌體的接種環(huán)放入液體培養(yǎng)基后,應在液體表面處的管內(nèi)壁上輕輕磨擦,使菌體從環(huán)上脫落,混進液體培養(yǎng)基,塞好試管塞后,搖動液體,使菌體在液體中分布均勻,或用試管振蕩器混勻。
向液體培養(yǎng)基中接種量大或要求定量接種時,可將無菌水或液體培養(yǎng)基注入菌種試管,用接種環(huán)將菌苔刮下,再將菌種懸液以無菌吸管定量吸出加入,或直接倒入液體培養(yǎng)基。如果菌種為液體培養(yǎng)物,則可用無菌吸管定量吸出加入或直接倒入液體培養(yǎng)基。整個接種過程都要求無菌操作。
三、半固體培養(yǎng)基穿刺接種
用接種針挑取菌種(針必須挺直),自培養(yǎng)基的中心垂直地刺入半固體培養(yǎng)基中,直至接近管底,但不要穿透,然后沿原穿刺線將針拔出,塞上試管塞,燒灼接種針。
左手將試管水平放置,右手拿接種針,將接種針水平穿入培養(yǎng)基中。
水平穿刺操作
右手將接種針豎直放置,左手將帶有培養(yǎng)基的試管倒立后,接種針穿入培養(yǎng)基中,見下圖。
倒立法穿刺操作
上述幾種接種法的無菌操作,凡未敘述的均按實驗一操作。試驗者應反復練習無菌操作接種技術,直至較熟練地掌握。
四、將已接種的斜面、液體和半固體培養(yǎng)基放置28—30℃溫箱,培養(yǎng)2—3天后取出觀察結果。
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