天然食品及食品原料多數(shù)本身具有特有的色澤和香味，人們?cè)陂L期的生活習(xí)慣中也認(rèn)識(shí)了各種食品應(yīng)有的色澤，食品的色澤已經(jīng)成為食品的一個(gè)重要感官指標(biāo)。然而，食品在保存及加工過程中，其色澤往往會(huì)有不同程度的變化，為了改善食品的色澤，使食品盡可能恢復(fù)原來的顏色，除采取一定護(hù)色措施外，往往還得添加一定量的食用色素，進(jìn)行著色。

食用色素就來源可分成兩大類：天然色素和合成色素

天然色素的優(yōu)缺點(diǎn)：

1、優(yōu)點(diǎn)：

⑴ 其色素是從一些動(dòng)物、植物組織中提取出來；

⑵ 安全性高；

2、缺點(diǎn)：

⑴ 穩(wěn)定性差（對(duì)光、熱、酸、堿等條件敏感）；

⑵ 著色能力差；

⑶ 難以調(diào)出任意的色澤；

⑷ 資源短缺，不能滿足食品工業(yè)的需求；

⑸ 價(jià)格昂貴。

合成色素優(yōu)缺點(diǎn)：

1、優(yōu)點(diǎn)：

⑴ 資源十分豐富（來自于煤焦油及其副產(chǎn)品）；

⑵ 穩(wěn)定性好、色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、能調(diào)出任意顏色；

⑶ 價(jià)格低廉；

⑷ 應(yīng)用廣泛；

2、缺點(diǎn)：

⑴ 毒性較大（因?yàn)閷俸铣伤�以毒性大，有的甚至致癌）�?/span>

⑵ 食用劑量加以限制。

對(duì)合成色素在測(cè)定時(shí)采用的幾大步驟如下：

樣品前處理→提純→分離→鑒別（何種色素）→定量（此色素含量是否超標(biāo)）

⑴ 前處理方法有：前處理不外乎是將樣品打漿或者將著色部分用刀刮下，定容、吸附、解吸等方法處理；

⑵ 提純的方法

（1） 羊毛染色法：此法應(yīng)用較廣泛，主要是簡單，材料容易弄到，操作也方便。缺點(diǎn)為：要在熱的酸性條件下吸附色素，用氨溶液解吸色素時(shí)，往往色素起變化。當(dāng)溶液中含量低時(shí)（色素含量低），用羊毛染色法吸附色素不完全，回收率低；

（2） 聚酰胺粉法：此法是分離兩種以上的色素，是目前比較理想的方法，因?yàn)槭称分写蠖鄶?shù)使用拼色。聚酰胺粉在酸性溶液中能與人工合成色素牢固地結(jié)合，并能在很稀的溶液中吸附色素，但對(duì)天然色素的吸附不緊密，能被甲醇-甲酸洗脫下來；

（3） 離子交換法

（4） 分子篩分離法

⑶ 目前分離方法

（1） 濾紙層析法；（2） 薄層層析法；（3） 柱層析法；（4） 電泳法

⑷ 色素鑒定方法

（1） 采用紙層析法進(jìn)行定性（與標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行對(duì)照 Rf）；

（2） 采用薄層層析、比色的方法進(jìn)行定量。

在食品中添加色素，經(jīng)常是由兩種以上的色素配合而成的拼色，對(duì)色素的測(cè)定，先處理、提純，然后把每一種色素要分離開，再對(duì)每一種色素的量進(jìn)行定量。

目前，在食品行業(yè)中使用單一色素已經(jīng)比較少，大多數(shù)使用復(fù)合色素方可達(dá)到比較滿意色澤，因而給分析工作者帶來一定困難。目前合成色素的測(cè)定方法主要有：(1)薄層層析法；(2)高效液相色譜法。

一、薄層層析法（聚酰胺粉法）

1、原理

聚酰胺是具有二極性的化合物，在酸性條件下與水溶性酸性染料結(jié)合，而與天然色素、蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等物質(zhì)分離，然后再在堿性條件下解吸色素，再在薄層層析法進(jìn)行分離鑒別，與標(biāo)準(zhǔn)比較定性、定量（紙層析進(jìn)行定性，薄層層析進(jìn)行定量）。

2、操作步驟

食品其形態(tài)是千變?nèi)f化的，添加在食品中的色素方式亦是各種各樣的，有的拼色加入，有的加在食品的表層幾個(gè)色素點(diǎn)，有的覆蓋一層色素, 有的用色素和雞蛋，很形象地作成傳說中的故事、動(dòng)物、花卉以及象征豐收、延年益壽、節(jié)日愉快、生日快樂等附在食品的最顯眼的地方，屬于這類食品的有中式糕點(diǎn)、西式糕點(diǎn)，還有飲料、小食品等色素的測(cè)定。樣品不同，處理方法則就不一樣。

⑴ 樣品表面色素的測(cè)定

如中式、西式、生日蛋糕、節(jié)日壽糕一類，首先將代表性的樣品整體稱重，記錄重量，然后分別取下相同著色部分，進(jìn)行提取和分離，不要將部分著色樣品和整個(gè)或大部分不著色樣品混在一起。如果這樣，分離就困難，而且增加分離誤差，使結(jié)果偏差大，例如一塊蛋糕重500g，取下色素部分經(jīng)測(cè)定是50mg，表示500g重的含量即萬分之一。

⑵ 樣品外皮色素的測(cè)定

如兒童食品中的糖豆、朱古力豆、紅心果等樣品，只需將外表皮色素用少量的水溶下來（在用水溶解之前，先稱重量并記錄），并定容一定體積（將沒有色素的樣品棄去），供檢驗(yàn)用，其計(jì)算與上面一樣。

⑶ 非酒精性飲料中色素的測(cè)定（各種汽水、桔子汁等）

(1) 吸附

吸50ml樣→與燒杯中→在電爐上加熱至沸→不斷攪拌除CO₂→加1g聚酰胺粉（60℃活化1小時(shí)）→充分?jǐn)嚢?rarr;使色素完全被聚酰胺粉吸附→用布氏漏斗過濾→用80℃熱水20ml洗沉淀物→用甲醇-甲酸（6︰4）20ml再洗沉淀物（除天然色素）→直到濾下來溶液無色→再用80℃熱水150ml分次洗沉淀物。

(2) 解吸

在不抽濾條件下，將9︰1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脫下來，收集于蒸發(fā)器中，水浴中濃液到5ml左右，加3滴20%檸檬酸溶液（使色素穩(wěn)定），定容10ml，供薄層點(diǎn)樣用。

(3) 注意事項(xiàng)

樣品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的檸檬酸調(diào)節(jié)pH=4（聚酰胺粉末在弱酸性溶液中對(duì)色素吸附力強(qiáng)，吸附亦完全）。

如果樣品不含天然色素，除CO₂后直接加聚酰胺吸附。

⑷ 對(duì)各種糖果色素的測(cè)定

1) 樣品處理

a.      硬糖（不含蛋白質(zhì)、淀粉）粉碎→稱樣3g→加50ml水溶解→再加30%檸檬酸3滴調(diào)pH=4

b.     軟糖（含淀粉高果飴）除外層冰糖屑→切碎→加50ml熱水溶解→用20%檸檬酸調(diào)pH=4→加淀粉酶1ml（消化淀粉）→90℃水浴15分鐘→溶液中出現(xiàn)沉淀物直到變清

c.     奶糖→加9︰1乙醇氨溶液溶解→用1︰10H₂SO₄調(diào)pH→加1%鎢酸鈉使蛋白質(zhì)沉淀，奶脂凝集沉淀→布氏漏斗抽濾

2) 吸附色素

1g聚酰胺粉+糖液→70℃水浴→攪拌使之充分吸附→用布氏漏斗抽濾→用80℃水洗漏斗上的沉淀物→再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）→再用80℃水洗沉淀物→洗到pH與原水相同

3) 解吸色素

沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸→收集于蒸發(fā)皿中→水浴濃液到4ml→加20%檸檬酸3滴→用水定容10ml→留做點(diǎn)樣用（單一色素直接比色，拼色要分離，先定性后定量）

⑸ 肉和肉制品中色素的測(cè)定

1) 前處理

稱處理樣→加海砂3g和20ml丙酮→于研缽中一起研→除去脂肪和水分→除去丙酮

2) 解吸樣液中的色素

將上面沉淀物放入布氏漏斗→用解吸液從肉蛋白中使色素全部解吸下來→加熱到70℃→用1︰10H₂SO₄調(diào)PH再加1ml10%鎢酸鈉→使蛋白質(zhì)全部凝聚沉淀→用布氏漏斗抽濾→用70℃水20ml洗漏斗→收集全部濾液

3) 吸附樣液中的色素

稱1g聚酰胺粉+上面的濾液→攪拌→抽濾→用水洗漏斗中沉淀物→直到濾水與原水PH相同

4) 解吸樣液中色素（與非酒精性飲料相同）

⑹ 果脯類色素的測(cè)定

1) 處理

取樣研碎后稱2g→加50ml水→加熱70℃使溶解

2) 吸附

吸附劑1g+上述液→抽濾→用70℃熱水洗沉淀物

3) 除天然色素

用甲醇-甲酸（6︰4）混合液解吸天然色素→直到濾液無色為止→再加甲醇10ml進(jìn)一步除天然色素→70℃熱水洗，不斷攪拌

4) 解吸

用解吸液解吸樣品沉淀物中全部人工合成色素→濃液解吸液（甲醇、氨）直到無甲醇、氨時(shí)→用1︰10H₂SO₄調(diào)pH=4→再按上述加吸附劑操作重復(fù)1-2次，把天然色素全部去凈為止，最后解吸、定容同上。

⑺ 各種加工蔬菜中色素的測(cè)定

這一類色素測(cè)定按理論應(yīng)該以蜜餞的操作來處理，但在實(shí)驗(yàn)中這些樣品膠體過多，使解吸、過濾等操作非常困難，所以我們應(yīng)該按下述方法進(jìn)行：取樣20g（干菜2g），加入100ml 80%的乙醇溶液，浸泡2小時(shí)，再以含有1%氨水的70%乙醇反復(fù)浸出，合并浸出液，直到色素全部被洗脫下來，置70-80℃水浴上，將全部浸出液濃縮，待氨全部逸出去（沒有氨味），調(diào)pH=4，加1g聚酰胺吸附，然后用布氏漏斗過濾，以200ml 70-80℃水洗滌漏斗的聚酰胺粉，然后用甲醇-甲酸洗脫天然色素。以上操作同蜜餞中色素的測(cè)定方法。

⑻ 提純色素溶液的紙層析定性

為了判斷樣品中存在有幾種色素以及是什么色素，必須進(jìn)行紙層析進(jìn)行鑒定。

經(jīng)濃縮后樣品色素溶液→于新華中速層析濾紙上點(diǎn)樣→點(diǎn)樣量3-5微升（若樣品含量低可取出1ml在濃縮至0.2ml再點(diǎn)樣）→點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑應(yīng)不超過2毫米為宜→點(diǎn)樣線距底邊2厘米→樣點(diǎn)間距離以及左右紙邊各距2厘米→用展開劑展開→測(cè)量各色素點(diǎn)的R_f值→于標(biāo)準(zhǔn)色素R_f值對(duì)照→確定何種色素（以標(biāo)準(zhǔn)色素斑點(diǎn)R_f值衡量樣品各色素斑點(diǎn)的R_f值是否于標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)在同一條直線上，色素的顏色是否完全一致，就可確定樣品色素屬于何種色素）。                       

Rf（比移值）=斑點(diǎn)移動(dòng)距離/溶劑前沿距離                        

所使用的展開劑有：

1)正丁醇︰無水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3

2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4

3)異丁醇︰無水乙醇︰水 = 3︰2︰2

⑼ 提純色素溶液的薄層分離和定量

經(jīng)過紙層析定性之后，含有一種色素的樣液定容之后，離心即可定量；含有兩種以上的復(fù)合色素的樣品溶液，需要經(jīng)過薄層分離為單色素后，再用比色法分別定量，測(cè)定出各種色素的含量。

具體步驟是：薄層板制板→點(diǎn)樣層析→比色→標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制→計(jì)算含量

1) 薄層板制備

聚酰胺粉1g于研缽中→加15ml 75%甲酸→攪拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅膠G→研磨1分鐘→立即涂板（玻璃板要求光滑平整，先用水洗凈，干燥后用酒精擦拭干凈，涂板時(shí)可用涂本器或手工玻璃涂布）→可涂15×10厘米玻璃板三塊（厚度為0.25-0.3毫米）→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→蓋好蓋子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小時(shí)→取出玻璃板→于空氣中風(fēng)干→于60-65℃烘箱30分鐘→放入干燥器中備用

2) 點(diǎn)樣層析

用點(diǎn)樣管（毛細(xì)管、微量注射器）將濃縮并定容的樣液點(diǎn)在薄層板上→基線距底邊2厘米→點(diǎn)成與底邊平行的條狀→兩端距邊各為2厘米，點(diǎn)樣量一般為0.4ml→點(diǎn)樣時(shí)要用電吹風(fēng)機(jī)邊點(diǎn)邊吹干→然后進(jìn)行展層析

展層缸先用溶劑系流30分鐘→再把點(diǎn)好樣的薄層板放入展析缸用上行法展開→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大約1小時(shí)看色素已明顯分開后→即可取出薄板→晾干

對(duì)溶劑系流的選擇是：a) 分離胭脂紅、莧菜紅、新紅、檸檬黃、桔黃、靛藍(lán)等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4（這種展開劑主要分離靛藍(lán)，因?yàn)榈逅{(lán)上升很快，其它上升很慢）；b) 分離檸檬黃、胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、桔黃等時(shí)用展開劑為2.5%檸檬酸鈉︰氨水=4︰3（檸檬黃上升很快，其它上升慢）；c) 對(duì)于分離兩種紅色素（莧菜紅、胭脂紅）的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水=10︰3︰4（主要是莧菜紅與胭脂紅上升快，其它色素上升慢）。

3) 比色定量

將薄層板展開后→用小刀分別將各條色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽濾→于水浴上蒸發(fā)到無氨味→定容10ml→分別測(cè)出消光值E（根據(jù)各種色素的最大吸收波長測(cè)定其光密度）→從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的各色素含量.

4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

先配成標(biāo)準(zhǔn)色素貯備液（100微克/ml），稱0.1g標(biāo)準(zhǔn)色素加水稀釋至1000ml

10ml比色管 0   1     2     3     4    5     6     7    8    9

標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 0  0.1  0.5  1.0  2.0  3.0  4.0  5.0  6.0 7.0

加水                     分別加水至10ml

相當(dāng)于μg/ml 0  1    5    10   20   30   40   50   60   70

分別測(cè)出E_O-E₉的消光值以水為參比，以色素濃度為橫生標(biāo)，消光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以水為參比，pH值為6，各色素的最大吸收波長為下：

胭脂紅 508納米；檸檬黃 428納米；莧菜紅 520納米；

晚霞黃 485納米；赤蘚紅 528納米；靛藍(lán)  610納米；

注意事項(xiàng)

1） 上述兩個(gè)公式若乘以1/100，即由mg/㎏變?yōu)閹?span lang="EN-US">/萬。例如胭脂紅含量為80mg/㎏即0.8/萬；2） 聚酰胺粉吸附要求預(yù)先活化，并要求在一定的溫度、pH和一定的作用時(shí)間下進(jìn)行，操作時(shí)要注意。聚酰胺在酸性條件下吸附色素牢固，用水洗滌聚酰胺粉以除去可溶性物質(zhì)，要求水偏酸性（pH=4），防止聚酰胺上色素在洗滌過程中脫落下來；

3）樣品的前處理和提純過程很重要，要充分去除雜質(zhì)（油脂、蛋白質(zhì)、淀粉、糖）以免影響吸附及層析效果。

一般能溶解在水中的物質(zhì)，如食鹽、糖、味精、香精等，在用酸性水洗滌聚酰胺粉時(shí)都能除去，還有明膠、果膠也可以通過大量水除去；對(duì)油脂類可以用丙酮或石油醚洗滌脫脂，如果油脂含量很高，可在研缽中用丙酮、海砂研磨除去；對(duì)于樣品中蛋白質(zhì)、淀粉含量高時(shí)，可用蛋白酶或鎢酸鈉、淀粉酶水解后除去；對(duì)于天然色素可用6︰4甲醇-甲酸除去；

4） 紙層析定性時(shí)不可皺折，邊緣應(yīng)剪齊，不可有毛邊，而且要注意紙的橫、豎向，應(yīng)順紋上行，展開較好，否則結(jié)果不規(guī)律；

5） 在濃縮樣液時(shí)應(yīng)控制水浴溫度70-80℃，應(yīng)使緩慢蒸發(fā)，勿濺出皿外，防止色素干結(jié)在蒸發(fā)皿的壁上（應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)蒸發(fā)皿）；

6） 靛藍(lán)褪色由深蘭色→淺蘭色→黃色→無色。靛藍(lán)褪色是由于光、氧、溫度高、PH等多種因素的影響，測(cè)定靛藍(lán)時(shí)要注意上述因素的影響；

7） 展開劑使用時(shí)最好2天換一次，以保證分離效果，放置時(shí)間過長造成濃度和極性都起變化，影響分離效果；

8）漏斗用完后要洗凈，先用濃HCl20ml少量多次洗，然后用水多次沖洗，否則影響下一個(gè)樣品的吸附或解吸作用；

9） 聚酰胺粉可回收使用。使用過的聚酰胺收集于干凈的燒杯中，用0.5%NaOH溶液浸泡24小時(shí)之后水泵抽干，倒回?zé)�杯，�?span lang="EN-US">0.1N HCl泡30分鐘，然后再用水泵抽干，用水洗至中性，置60℃烘箱烘干備用；

10） 比色時(shí)樣液要求清晰，若混濁使E增大，影響結(jié)果，如果混濁可離心也可放置。