一、目的與要求:
1、明確測(cè)定各類(lèi)色素的原理與方法。
2、通過(guò)此實(shí)驗(yàn)掌握紙層析定性法與提純色素的定量法。
二、原理:
聚酰胺是具有二極性的化合物,水溶性酸性染料在酸性條件下被聚酰胺吸附,而在堿性條件下解吸附,再用紙色譜法或薄層色譜法進(jìn)行分離后與標(biāo)準(zhǔn)比較定性、定量。
三、試劑:
1、聚酰胺粉(尼龍6)
2、硫酸1:1 0
3、甲醇—甲酸溶液:6:4
4、甲醇
5、20%檸檬酸溶液
6、10%鎢酸鈉溶液
7、石油醚:沸程60-90℃
8、海砂:先用l:10鹽酸煮沸15min,用水洗中性,再用5%氫氧化鈉溶液煮沸15min,再于105℃干燥,貯于具玻璃塞的瓶中,備用。
9、乙醇-氨溶液:取1毫升氨水,加70%乙醇至100毫升。
10、50% 乙醇溶液
11、硅膠G。
12、PH6的水:用20%檸檬酸調(diào)節(jié)至PH 6。
13、鹽酸: 1:10
14、5%氫氧鈉溶液
15、碎瓷片:處理方法同海砂
16、展開(kāi)劑
a、正丁醇-無(wú)水乙醇-1%氨水(6:2:3):供紙色譜用。
b、正丁醇-吡啶-1%氨水(6:3:4):供紙色譜用。
c、甲乙酮-丙酮-水(7:3:3):供紙色譜用。
d、甲醇-乙二胺-氨水(10:3:2):供薄層色譜用。
e、甲醇-氨水-乙醇(5:1:10):供薄層色譜用。
f、2.5%檸檬酸鈉-氨水-乙醇(8:1:2)供薄層色譜用。
17、色素標(biāo)準(zhǔn)溶液{以下商品作為標(biāo)準(zhǔn)以100%計(jì)。
胭脂紅:純度60%;莧菜紅:純度60%;檸檬黃:純度60%;靛藍(lán):純度40%;日落黃:純度60%,亮藍(lán);純度60%。
精密稱(chēng)取上述色素各0.100克,用PH6的水溶解,移入100毫升容量瓶中并稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于1毫克商品色素。靛藍(lán)溶液需在暗處保存。
18、色素標(biāo)準(zhǔn)使用液:用時(shí)吸取色素標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.0毫升,分別置于50毫升容量瓶中,加PH6的水稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于0.1毫克商品色素。
四、儀器:
1、分光光度計(jì)
2、微量注射器或色素吸管
3、展開(kāi)槽,25 X 6 x 4cm
4、層析缸
5、濾紙、中速濾紙,紙色譜用
6、薄層板:5 X 20em
7、電吹風(fēng)機(jī)
8、水泵
五、操作方法:
1、樣品處理
A、果味水、果子露、汽水:吸取50.0毫升樣品于100毫升燒杯中,汽水需加熱驅(qū)除二氧化碳。
B、配制酒:吸取100.0毫升樣品于燒杯中,加碎瓷片數(shù)塊,加熱驅(qū)除乙醇。
C、硬糖:蜜餞類(lèi),淀粉軟糖:稱(chēng)取5.0或10.0克粉碎的樣品,加30毫升水,溫?zé)崛芙,若樣液PH值較高,用20%檸檬酸溶液調(diào)至PH4左右。
D、含蛋奶的樣品
(1)奶糖:稱(chēng)取10.0克粉碎均勻的樣品,加30毫升乙醇-氨溶液溶解,置水浴上濃縮至約20毫升,立即用1:10硫酸調(diào)溶液至微酸隆再加1.0毫升1:l0硫酸,加1毫升l0%鎢酸鈉溶液,使蛋白質(zhì)沉淀,過(guò)濾,用少量水洗滌,收集濾液。
(2)蛋糕類(lèi):稱(chēng)取10.0克粉碎均勻的樣品,加海砂少許,混勻、用熱風(fēng)風(fēng)干樣品(用手摸已干燥即可以),加入30毫升石油醚攪拌,放置片刻,傾出石油醚,如此重復(fù)處理三次,以除去脂肪吹干后研細(xì),全部轉(zhuǎn)人G3垂融漏斗或普通漏斗中,用乙醇—氨溶液提取色素,直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下濃縮至約20毫升”起依法操作。
2、吸附分離
將處理后所得的溶液加熱至70℃,加入0.5-1.0克聚酰胺粉充分?jǐn)嚢,?0%檸檬酸溶液調(diào)PH至4,使色素完全被吸附,若溶液還有顏色,可以再加一些聚酰胺粉。將吸附色素的聚酰胺全部轉(zhuǎn)入G3垂融漏斗或玻璃漏斗中過(guò)濾(如用G3垂融漏斗過(guò)濾,可以用水泵慢慢地抽濾)。用20%檸檬酸酸化PH=4的70℃水反復(fù)洗滌,每次20毫升,邊洗邊攪拌,若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗滌1-3次,每次20毫升,至洗液無(wú)色為止。再用70℃水多次洗滌至流出的溶液為中性。洗滌過(guò)程中必須充分?jǐn)嚢。然后用乙?氨溶液分次解吸全部色素,收集全部解吸液,于水浴上驅(qū)氨。如果為單色,則用水準(zhǔn)確稀釋至50毫升,用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。如果為多種色素混合液,則進(jìn)行紙色譜或薄層色譜法分離后測(cè)定,即將上述溶液置水浴上濃縮至約2毫升后移人5毫升容量瓶中,用50%乙醇洗滌容器,洗液并入容量瓶中并稀釋至刻度。
3、定性
A、紙色譜
取色譜用紙,在距底邊2cm的起始線(xiàn)上分別點(diǎn)3-10微升樣品溶液,1-2微升色素標(biāo)準(zhǔn)溶液,掛于分別盛有a、b、c、d、e、f的展開(kāi)劑的層析缸中,用上行法展開(kāi),待溶劑前沿展至15cm處,將濾紙取出于空氣中晾干,與標(biāo)準(zhǔn)斑比較定性。
也可取0.5毫升樣液,在起始線(xiàn)上從左到右點(diǎn)成條狀,紙的右邊點(diǎn)色素標(biāo)準(zhǔn)溶液,依法展開(kāi),晾干后先定性后定量,靛藍(lán)在堿性條件下易褪色可用e展開(kāi)劑。
B、薄層色譜
(1)薄層板的制備
稱(chēng)取1.6克聚胺粉,0.4克可溶性淀粉及2克硅膠G,置于合適的研缽中,加15毫升水研勻后,立即置涂布器中鋪成厚度為0.3mm的板。在室溫晾干后,于80℃干燥1小時(shí)置于燥器中備用。
(2)點(diǎn)樣
離板底邊2cm處將0.5毫升樣液從左到右點(diǎn)成與底邊平行的條狀的右邊點(diǎn)2微升色素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
(3)展開(kāi)
莧菜紅與胭脂紅用d展開(kāi)劑,靛藍(lán)與亮藍(lán)用e展開(kāi)劑,檸檬黃與其他色素用f展開(kāi)劑。取適量展開(kāi)劑倒入展開(kāi)槽中,將薄層板放入展開(kāi),待色素明顯分開(kāi)后取出,晾干,與標(biāo)準(zhǔn)斑比較,如比移值相同即為同一色素。
4、定量
A樣品測(cè)定
將紙色譜的條狀色斑剪下,用少量熱水洗滌數(shù)次,洗液移入10毫升比色管中,并加水稀釋至刻度,作比色法定用。
將薄層色譜的條狀色斑包括有擴(kuò)散的部分,分別用刮刀刮下,移入漏斗中,用乙醇-氨溶液解吸色素,少量反復(fù)多次至解吸液無(wú)色,收集解吸液于蒸發(fā)皿中,于水浴上揮發(fā)除去氨,移入10毫升比色管中,加水至刻度作比色用。
B、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備
分別吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml胭脂紅,檸檬黃,日落黃色素標(biāo)準(zhǔn)使用液或0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml亮藍(lán),靛藍(lán)色素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別置于10ml比色管中,各加水稀釋至刻度。
上述樣品與標(biāo)準(zhǔn)管分別用1cm比色杯,以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn),于一定波長(zhǎng)下(胭脂紅510nm,莧菜紅520nm,檸檬黃430nm,日落黃482nm,亮藍(lán)627nm),測(cè)定吸光度,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較或與標(biāo)準(zhǔn)色列目測(cè)比較。
計(jì)算:
X=(A*100)/(m*V2/V1*1000)
式中:
X:樣品中色素的含量,克/千克/升
A:測(cè)定用樣液中色素的含量,毫克
:m:樣品質(zhì)量(體積),克(毫克)
V1:樣品解吸后總體積,毫升
V1:樣液點(diǎn)板(紙)體積,毫升