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細菌的鞭毛染色

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-05-11
核心提示:(一)實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)細菌的鞭毛染色法(二)實驗原理:細菌的鞭毛極細,直徑一般為10—20nm,只有用電子顯微鏡才能觀察

(一)實驗?zāi)康模?/span>學(xué)習(xí)細菌的鞭毛染色法

(二)實驗原理:細菌的鞭毛極細,直徑一般為10—20nm,只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是,如采用特殊的染色法,則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先用媒染劑處理,讓它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成,F(xiàn)推薦以下兩種染色法。

(三)實驗器材

1.活材料:培養(yǎng)12-16h的水稻黃單胞菌Xanthomonas oryzae),粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratia marcescens)或假單細胞菌(Pseudomonas sp.)斜面菌種。

2.染色液和試劑:硝酸銀染色液見附二、、8、Leifson染色液見附二、(一、9、香柏油、二甲苯。

3.器材:載片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、片擱架、鑷子、接種環(huán),顯微鏡。

(四)實驗方法

1.鍍銀法染色

1)清洗片  選擇光滑無裂痕的片,最好選用新的。為了避免玻片相互重疊,應(yīng)將片插在專用金屬架上,然后將玻片置洗衣粉過濾液中(洗衣粉煮沸后用濾紙過濾,以除去粗顆粒),煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干,再放入濃洗液中浸泡5—6天,使用前取出片,用自來水沖去殘酸,再用蒸餾水洗。將水瀝干后,放入95%乙醇中脫水。

2)菌液的制備及制片:菌齡較老的細菌容易失落鞭毛,所以在染色前應(yīng)將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上(培養(yǎng)基表面濕潤,斜面基部含有冷凝水)連續(xù)移接3-5代,以增強細菌的運動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養(yǎng)12—16h。然后,用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán),移至盛有1—2mL無菌水的試管中,使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37℃恒溫箱中靜置10min(放置時間不宜太長,否則鞭毛會脫落),讓幼齡菌的鞭毛松展開。然后,吸取少量菌液滴在潔凈片的一端,立即將片傾斜,使菌液緩慢地流向另一端,用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。

用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無菌平中,待凝固后在平板中央點接活化了3-4代的細菌,恒溫培養(yǎng)12-16h后,取擴散菌落的邊緣制作涂片。

3)染色

滴加A液,染4—6min。

②用蒸餾水充分洗凈A液。

③用B液沖去殘水,再加B液于片上,在酒精燈火焰上加熱至冒氣,約維持0.5—1min(加熱時應(yīng)隨時補充蒸發(fā)掉的染料,不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū))。

④用蒸餾水洗,自然干燥。

4)鏡檢:先低,再高倍,最后用油鏡檢查。

結(jié)果:菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色。

2.改良Leifson染色法

1)清洗片法同1。

2)配制染料  見附錄二(一)9。染料配好后要過濾15-20次后染色效果才好。

3)菌液的制備及涂片

①菌液的制備同1。

②用記號筆在潔凈的片上劃分3—4個相等的區(qū)域。

③放1滴菌液于第一個小區(qū)的一端,將片傾斜,讓菌液流向另一端,并用濾紙吸去多余的菌液。

④干燥  在空氣中自然干燥。

4)染色

①加染色液于第一區(qū),使染料覆蓋涂片。隔數(shù)分鐘后再將染料加入第二區(qū),依此類推(相隔時間可自行決定),其目的是確定最合適的染色時間,而且節(jié)約材料。

②水洗:在沒有傾去染料的情況下,就用蒸餾水輕輕地沖去染料,否則會增加背景的沉淀。

③干燥:自然干燥。

5)鏡檢  先低觀察,再高倍觀察,最后再用油鏡觀察,觀察時要多找一些視野,不要企圖在1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛。

結(jié)果:菌體和鞭毛均染成紅色。

(五)實驗作業(yè):給出鞭毛菌的形態(tài)圖

(六)注意事項

1.鍍銀法染色比較容易掌握,但染色液必須每次現(xiàn)配現(xiàn)用,不能存放,比較麻煩。

2.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響,且染色液須經(jīng)15-20次過濾,要掌握好染色條件必須經(jīng)過一些摸索。

3.細菌鞭毛極細,很易脫落,在整個操作過程中,必須仔細小心,以防鞭毛脫落。

4.染色用片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。

:細菌的運動性觀察

(一)實驗原理  細菌是否具有鞭毛是細菌分類鑒定的重要特征之一。采用鞭毛染色法雖能觀察到鞭毛的形態(tài)、著生位置和數(shù)目,但此法既費時又麻煩。如果僅須了解某菌是否有鞭毛,可采用懸滴法或水封片法(即壓滴法)直接在光學(xué)顯微鏡下檢查活細菌是否具有運動能力,以此來判斷細菌是否有鞭毛。此法較快速、簡便。

懸滴法就是將菌液滴加在潔凈的蓋片中央,在其周邊涂上凡士林,然后將它倒蓋在有凹槽的載片中央,即可放置在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。水封片法是將菌液滴在普通的載片上,然后蓋上蓋片,置顯微鏡下觀察。

大多數(shù)球菌不生鞭毛,桿菌中有的有鞭毛有的無鞭毛,弧菌和螺菌幾乎都有鞭毛。有鞭毛的細菌在幼齡時具有較強的運動力,衰老的細胞鞭毛易脫落,故觀察時宜選用幼齡菌體。

(二)實驗器材

1.活材料:培養(yǎng)12-16h小時的枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、假單胞菌Pseudomonas sp.)。

2.試劑:香柏油、二甲苯、凡士林等。

3.器材:片、蓋片、鑷子、接種環(huán)、滴管、擦鏡紙、顯微鏡。

(三)實驗方法:

1.制備菌液:在幼齡斜面上,滴加3-4mL無菌水,制成輕度混濁的菌懸液。

2.涂凡士林:取潔凈無油的蓋片1塊,在其四周涂少量的凡士林。

3.滴加菌液:加1滴菌液于蓋片的中央,并用記號筆在菌液的邊緣做一記號,以便在顯微鏡觀察時,易于尋找菌液的位置。

4.蓋凹玻片  將凹玻片的凹槽對準(zhǔn)蓋片中央的菌液,并輕輕地蓋在蓋片上,使兩者粘在一起,然后翻轉(zhuǎn)凹玻片,使菌液正好懸在凹槽的中央,再用鉛筆或火柴棒輕壓蓋片,使片四周邊緣閉合,以防菌液干燥。

若制水封片,在載上滴加一滴菌液,蓋上蓋片后即可置顯微鏡下觀察。

5.鏡檢  先用低倍鏡找到標(biāo)記,再稍微移動凹玻片即找到菌滴的邊緣,然后將菌液移到視野中央換高倍鏡觀察。由于菌體是透明的,鏡檢時可適當(dāng)縮小光圈或降低聚光器以增大反差,便于觀察。鏡檢時要仔細辨別是細菌的運動還是分子運動(即布朗運動),前者在視野下可見細菌自一處游動至他處,而后者僅在原處左右擺動。細菌的運動速度依菌種不同而異,應(yīng)仔細觀察。

結(jié)果:有鞭毛的枯草桿菌和假單胞菌可看到活躍的運動,而無鞭毛的金黃色葡萄球菌不運動。

(四)實驗作業(yè):繪出所看到的細菌的形態(tài)圖,并用箭頭表示其運動方向。

(五)注意事項

1.檢查細菌運動的載片和蓋片都要潔凈無油,否則將影響細菌的運動。

2.制水封片時菌液不可加得太多,過多的菌液會在蓋片下流動,因而在視野內(nèi)只見大量的細菌朝一個方向運動,從而影響了對細菌正常運動的觀察。

3.若使用油鏡觀察,應(yīng)在蓋玻片上加香柏油一滴。

編輯:foodyy

 
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